概要

Проточная цитометрическая характеристика развития В-клеток мышей

Published: January 22, 2021
doi:

概要

Мы описываем здесь простой анализ гетерогенности компартмента иммунных В-клеток мышей в тканях брюшины, селезенки и костного мозга с помощью проточной цитометрии. Протокол может быть адаптирован и распространен на другие ткани мыши.

Abstract

Обширные исследования характеризуют развитие и дифференцировку мышиных В-клеток во вторичных лимфоидных органах. Антитела, секретируемые В-клетками, были выделены и развиты в хорошо зарекомендовавшие себя терапевтические средства. Валидация развития В-клеток мышей в контексте аутоиммунных склонных мышей или у мышей с модифицированной иммунной системой является важнейшим компонентом разработки или тестирования терапевтических агентов на мышах и является надлежащим использованием проточной цитометрии. Хорошо зарекомендовавшие себя цитометрические параметры потока В-клеток могут быть использованы для оценки развития В-клеток в брюшине мышей, костном мозге и селезенке, но необходимо придерживаться ряда лучших практик. Кроме того, проточный цитометрический анализ компартментов В-клеток должен также дополнять дополнительные показания развития В-клеток. Данные, полученные с помощью этого метода, могут способствовать нашему пониманию моделей мышей дикого типа, склонных к аутоиммунным заболеваниям, а также гуманизированных мышей, которые могут быть использованы для генерации антител или молекул, подобных антителам, в качестве терапевтических средств.

Introduction

Моноклональные антитела все чаще становятся предпочтительной терапией для многих заболеваний человека, поскольку они становятся частью основной медицины1,2. Ранее мы описали генетически модифицированных мышей, которые эффективно вырабатывают антитела, скрывающие полностью переменные области человека с константами IgH мыши3,4. Совсем недавно мы описали генетически модифицированных мышей, которые продуцируют антителоподобные молекулы, которые имеют отчетливое связывание антигенов5. Антитела секретируются В-клетками и составляют основу адаптивного гуморального иммунитета. Существует два различных типа В-клеток, B-1 и B-2. У млекопитающих клетки B-1 возникают в печени плода и обогащаются тканями слизистой оболочки и плевральной и брюшной полостями после рождения, в то время как клетки B-2 возникают в печени плода до рождения, а затем в костном мозге (БМ). Клетки B-2 обогащаются вторичными лимфоидными органами, включая селезенку и кровь6,7,8. В БМ гемопоэтические предшественники B-2 начинают дифференцироваться в про-В-клетки после инициирования перестройки тяжелой цепи Ig mu9,10. Успешная перестройка тяжелой цепи Ig и ее сборка в пре-В-клеточный рецептор (пре-BCR), наряду с сигнальной и пролиферативной экспансией, приводит к дифференцировке в пре-В-клетки. После того, как пре-В-клетки перестраивают свои легкие цепи Ig kappa (Igκ) или, если это непродуктивно, легкие цепи Ig lambda (Igλ), они соединяются с μ тяжелой цепи, что приводит к поверхностной экспрессии IgM BCR. Важно отметить, что поверхностная экспрессия IgM, как известно, снижается в условиях аутореактивности, что способствует самотолерантности в функционально невосприимчивых или анергических В-клетках11,12. Незрелые В-клетки затем вступают в переходную стадию, где они начинают совместно экспрессировать IgD и мигрируют из БМ в селезенку. В селезенке экспрессия IgD еще больше увеличивается, и клетки созревают во вторую стадию переходных В-клеток, за которой следует завершение их статуса созревания и развитие либо в клетки маргинальной зоны (MZ), либо в фолликулярные (Fol) клетки13,14,15. У взрослых мышей, в неболеющих условиях, количество зрелых В-клеток остается постоянным, несмотря на то, что ежедневно в БМ генерируется 10-20 миллионов незрелых В-клеток. Из них только три процента попадают в пул зрелых В-клеток. Размер периферического В-клеточного компартмента ограничен гибелью клеток, отчасти из-за нескольких факторов, включая самореактивность и неполное созревание16,17,18. Проточный цитометрический анализ широко использовался для характеристики и перечисления многих субкомпонентов иммунных клеток у людей и мышей. Хотя существует некоторое сходство между человеческими и мышиными В-клеточными компартментами, этот протокол применяется только к анализу мышиных В-клеток. Этот протокол был разработан с целью фенотипирования генетически модифицированных мышей, чтобы определить, изменят ли генетические манипуляции развитие В-клеток. Проточная цитометрия также была чрезвычайно популярна во многих дополнительных приложениях, в том числе при измерении активации клеток, функции, пролиферации, анализа циклов, анализа содержания ДНК, апоптоза и сортировки клеток 19,20.

Проточная цитометрия является предпочтительным инструментом для характеристики различных лимфоцитарных компартментов у мышей и людей, в том числе в сложных органах, таких как селезенка, БМ и кровь. Благодаря широко доступным мышино-специфическим реагентам антител для проточной цитометрии, этот метод может быть использован для исследования не только белков клеточной поверхности, но и внутриклеточных фосфопротеинов и цитокинов, а также функциональных показаний21. Здесь мы демонстрируем, как реагенты проточной цитометрии могут быть использованы для идентификации подмножеств В-клеток по мере их созревания и дифференцировки во вторичных лимфоидных органах. После оптимизации условий окрашивания, обработки образцов, правильной настройки прибора и сбора данных и, наконец, анализа данных можно использовать протокол комплексного проточного цитометрического анализа компартмента В-клеток у мышей. Такой комплексный анализ основан на десятилетней номенклатуре, разработанной Харди и его коллегами, где развивающиеся клетки BM B-2 могут быть разделены на различные фракции (Fraction) в зависимости от их экспрессии B220, CD43, BP-1, CD24, IgM и IgD22. Hardy et al., показали, что B220+ CD43 BM B-клетки могут быть подразделены на четыре подмножества (фракция A-C’) на основе экспрессии BP-1 и CD24 (30F1), в то время как B220+ CD43-(тусклые до отрицательных) BM B-клетки могут быть разрешены на три подмножества (фракция D-F) на основе дифференциальной экспрессии IgD и поверхностного IgM23. Фракция A (пре-про-В клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1), фракция B (ранние про-В-клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)+, фракция C (поздние про-В-клетки) определяется как BP-1+ CD24 (30F1)+, а фракция C’ (ранние клетки пре-В) определяется как BP-1+ и CD24high. Кроме того, фракция D (пре-В-клетки) определяется как B220+ CD43-IgM-В-клетки, а фракция E (вновь генерируемые В-клетки, комбинация незрелых и переходных) определяется как B220+ CD43-IgM+ В-клетки, а фракция F (зрелые, рециркулирующие В-клетки) определяется как B220-высокие CD43-IgM+ В-клетки. Напротив, большинство наивных В-клеток, обнаруженных в селезенке, можно разделить на зрелые (B220 + CD93-) В-клетки и переходные (T1, T2, T3) клетки в зависимости от экспрессии CD93, CD23 и IgM. Зрелые В-клетки могут быть разрешены на маргинальные зоны и фолликулярные подмножества на основе экспрессии IgM и CD21/CD35, а фолликулярные подмножества могут быть дополнительно разделены на зрелые фолликулярные подмножества клеток типа I и фолликулярные подмножества В-клеток типа II в зависимости от уровня их поверхностной экспрессии IgM и IgD24. Эти селезеночные популяции В-клеток экспрессируют преимущественно Igκ легкую цепь. Наконец, популяции В-клеток B-1, которые происходят из печени плода и в основном находятся в брюшной и плевральной полостях взрослых мышей, были описаны в литературе. Эти перитонеальные В-клетки можно отличить от ранее описанных В-2 В-клеток по отсутствию экспрессии CD23. Затем они далее подразделяются на популяции B-1a или B-1b, причем первые определяются присутствием CD5, а вторые – его отсутствием25. Предшественники клеток B-1 в изобилии присутствуют в печени плода, но не обнаруживаются во взрослом БМ. Хотя клетки B-1a и B-1b происходят от разных предшественников, они оба засеивают брюшную и плевральную полости24. В отличие от клеток B-2, клетки B-1 уникально способны к самообновлению и отвечают за выработку естественных антител IgM.

Дефекты в развитии В-клеток могут возникать во многих случаях, включая недостатки в компонентах BCR26,27, возмущения сигнальных молекул, которые влияют на силу передачи сигналов BCR14,28,29, или нарушение цитокинов, которые модулируют выживание В-клеток30,31 . Анализ проточной цитометрии лимфоидных компартментов способствовал характеристике блоков развития В-клеток у этих мышей и многих других. Одним из преимуществ проточного цитометрического анализа лимфоидных компартментов является то, что он предлагает возможность проводить измерения на отдельных клетках, полученных из живой диссоциированной ткани. Наличие реагентов в постоянно расширяющемся диапазоне флуорофоров позволяет проводить одновременный анализ нескольких параметров и позволяет оценивать гетерогенность В-клеток. Кроме того, перечисление В-клеток методом проточного цитометрического анализа дополняет другие иммунологические анализы, такие как методы иммуногистохимии, которые визуализируют локализацию клеток в лимфоидных органах, обнаружение уровней циркулирующих антител в качестве меры гуморального иммунитета, а также две фотонные микроскопии для измерения реакций В-клеток в реальном пространстве и времени32.

Protocol

Все исследования на мышах контролировались и утверждались Комитетом по уходу и использованию животных Regeneron (IACUC). Эксперимент проводился на тканях трех самок мышей C57BL/6J (17-недельного возраста) из Jackson Laboratories. Титруйте все антитела перед началом эксперимента, чтобы определить идеальную …

Representative Results

Здесь мы представляем стратегию гатинга для характеристики развития В-клеток в брюшине мыши, БМ и селезенке. Основа анализа формируется вокруг концепции окрашивания красителем жизнеспособности, затем вытеснения дублетов на основе области прямого рассеяния (FSC-A) и вы?…

Discussion

Проточный цитометрический анализ лимфоидных и нелимфоидных тканей позволил одновременно идентифицировать и перечислить субпопуляции В-клеток у мышей и людей с 1980-х годов. Он был использован в качестве меры гуморального иммунитета и может быть применен в дальнейшем для оценки функцио…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Мэтью Слимана за критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим отделы операций вивария и проточной цитометрии в Regeneron за поддержку этого исследования.

Materials

0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes Eppendorf  22363611 0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes  Eppendorf  22364111 1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes  Corning  352097 15 mL conical tube
18 gauge needle BD 305196
25 gauge needle BD  305124
3 mL syringe BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer  Miltenyi Biotec  130-110-916  70 mM cell strainer
96 well U bottom plate  VWR 10861-564
ACK lysis buffer  GIBCO  A1049201 red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate Pall Corporation 8027 filter plate
B220 eBiosciences 17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ BD 552843 compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ BD 552844 compensation beads
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A8577 BSA
BP-1 BD 740882
Brilliant Stain Buffer BD 566349 brilliant stain buffer
C-Kit BD 564011
CD11b BD 563168
CD11b BioLegend 101222
CD19 BD 560143
CD21/35 BD 562756
CD23  BD 740216
CD24 (HSA) BioLegend 138504
CD3 BD 561388
CD3 BioLegend 100214
CD43 BD 553270
CD43 BioLegend 121206
CD5 BD 563194
CD93 BD 740750
CD93 BioLegend 136504
DPBS (1x) ThermoFisher 14190-144 DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 ThermoFisher 65-0866-14 viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette Samco 233 disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer BD custom order flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) BD 553142 Fc block
FlowJo Flowjo flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes  Miltenyi Biotec  130-096-334 automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters  Miltenyi Biotec  130-095-937 tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G) BioLegend 108422
IgD BioLegend 405710
IgM eBiosciences 25-5790-82
Kappa BD 550003
Lambda BioLegend 407308
paraformaldehyde, 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714
Ter119 BioLegend 116220
True-Stain Monocyte Blocker BioLegend 426103 monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575038 EDTA
Vi-CELL XR Beckman Coulter 731050 cell counter instrument 

参考文献

  1. Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
  4. Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
  5. Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
  6. Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
  7. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
  8. Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
  9. Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
  10. von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
  11. Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  12. Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
  13. Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
  14. Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
  15. Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
  16. Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
  17. Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
  18. Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
  19. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
  20. Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
  21. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  22. Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
  23. Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
  24. Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
  25. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  26. Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
  27. Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
  28. Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
  29. Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
  30. Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
  31. Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
  32. Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
  33. Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
  34. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
  35. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
  36. Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
  37. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).

Play Video

記事を引用
Harris, F. M., Meagher, K. A., Zhong, M., Daniel, B. J., Eckersdorff, M., Green, J. A., Voronina, V., Guo, C., Limnander, A., Macdonald, L. E. Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development. J. Vis. Exp. (167), e61565, doi:10.3791/61565 (2021).

View Video