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発生生物学

Imaging di animali interi di Drosophila melanogaster utilizzando la tomografia microincisa

Published: September 02, 2020
doi:
10.3791/61515
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

概要

Viene presentato un protocollo che consente la visualizzazione di Drosophila melanogaster intatto in qualsiasi fase dello sviluppo utilizzando la tomografia microincisa.

Abstract

Gli strumenti di imaging biomedico consentono di investigarsi dei meccanismi molecolari attraverso scale spaziali, dai geni agli organismi. Drosophila melanogaster, un organismo modello ben caratterizzato, ha beneficiato dell’uso della luce e della microscopia elettronica per comprendere la funzione genica a livello di cellule e tessuti. L’applicazione di piattaforme di imaging che consentano una comprensione della funzione genica a livello dell’intero organismo intatto migliorerebbe ulteriormente la nostra conoscenza dei meccanismi genetici. Qui viene presentato un metodo di imaging di animali interi che delinea i passaggi necessari per visualizzare Drosophila in qualsiasi fase dello sviluppo utilizzando la tomografia microcomputata (μ-CT). I vantaggi di μ-CT includono strumentazione disponibile in commercio e tempi pratici minimi per produrre informazioni 3D accurate a livello di micron senza la necessità di metodi di dissezione o compensazione dei tessuti. Abbinato a software che accelerano l’analisi delle immagini e il rendering 3D, è possibile eseguire un’analisi morfometrica dettagliata di qualsiasi tessuto o sistema di organi per comprendere meglio i meccanismi di sviluppo, fisiologia e anatomia per studi di test sia descrittivi che di ipotesi. Utilizzando un flusso di lavoro di imaging che incorpora l’uso di microscopia elettronica, microscopia ottica e μ-CT, è possibile eseguire una valutazione approfondita della funzione genica, promuovendo così l’utilità di questo potente organismo modello.

Introduction

I metodi di imaging che consentono l’indagine dettagliata delle strutture interne di un oggetto senza distruggere la sua architettura 3D complessiva si sono dimostrati ampiamente utili per una serie di discipline diverse, tra cui fisica, ingegneria, scienza dei materiali, archeologia, paleontologia, geologia e biologia1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Tra questi metodi di imaging non distruttivi, le piattaforme basate sui raggi X sono particolarmente utili grazie alla capacità dei raggi X ad alta energia di penetrare molti tipi di campioni e materiali diversi con una dispersione minima rispetto alle onde luminose visibili. La tomografia computerizzata (CT), la tomografia microcomputata (μ-CT), la tomografia nanocomputata (Nano-CT) e la microtomografia di sincrotrone sono quindi emerse come le tecnologie primarie per l’imaging a raggi X di campioni che vanno dai metri ai micron, con capacità di risoluzione da millimetro a sub-micron10,11, 12,13,14.

Mentre queste piattaforme differiscono nel loro design, geometria a raggi X e componenti al fine di bilanciare le dimensioni del campione e la risoluzione, si basano tutte sullo stesso principio di base per l’acquisizione delle immagini: una fonte di raggi X che viaggiano attraverso l’oggetto e vengono catturati da un rilevatore. L’attenuazione differenziale del fascio di raggi X mentre passa attraverso densità variabili all’interno dell’oggetto genera contrasto dell’immagine. I dati 3D si ottengono ruotando il campione o il rivelatore, raccogliendo una serie di immagini di proiezione 2D che vengono poi ricostruite utilizzando algoritmi in tomogrammi contenenti informazioni 3D la cui risoluzione è isotropa in x,y,z15. Per molti scanner μ-CT da banco che utilizzano una geometria a raggi X a fascio cono per proiettare raggi X sull’oggetto da visualizzare, l’algoritmo Feldkamp viene utilizzato per ricostruire con precisione l’oggetto con errori minimi16.

La risoluzione di una determinata piattaforma è determinata principalmente da parametri di sistema come la dimensione del fascio di raggi X (dimensione dello spot), la geometria dello scanner (distanza dall’oggetto alla sorgente di raggi X), la dimensione dei pixel sul rilevatore e l’algoritmo di ricostruzione utilizzato. Fattori aggiuntivi, come le vibrazioni dello scanner, le fluttuazioni del fascio di raggi X, il movimento del campione e il tipo di materiale o la macchia chimica utilizzata per visualizzare l’oggetto possono anche influenzare in modo significativo la risoluzione spaziale sotto le condizioni di imaging del mondo reale15.

Per le applicazioni biomediche, CT e μ-CT hanno svolto un ruolo chiave nel far progredire la nostra comprensione dell’anatomia, della fisiologia, dello sviluppo e dei meccanismi di malattia, fungendo da strumento sia per le diagnosi dei pazienti umani che come piattaforma di imaging preclinico per organismi modello17,18. Ad esempio, il Mouse International Phenotyping Consortium, il cui obiettivo è identificare la funzione di ogni gene nel genoma del topo, utilizza μ-CT come parte della loro pipeline di fenotipizzazione19. I loro risultati sono stati fondamentali per comprendere i geni coinvolti nello sviluppo e nei processi patologici, fungendo anche da atlante per l’anatomia e lo sviluppo del topo20. Altri organismi modello, come zebrafish e ratti, hanno anche abbracciato pienamente l’uso di μ-CT per eseguire la fenotipizzazione di animali interi di un numero di mutantigenetici 17,21,22,23.

Il vantaggio di combinare l’imaging di animali interi con organismi modello è che una comprensione meccanicistica della funzione genica per un dato processo biologico può essere completamente esplorata. Ciò è possibile grazie ai genomi ben caratterizzati e a molti strumenti genetici disponibili negli organismi modello che consentono una manipolazione precisa della funzione genica in distinti punti temporali dello sviluppo, tessuti specifici, singole cellule e persino organelli subcellulari. Questi includono sistemi di espressione binaria come il sistema UAS / GAL4 (e le sue molte derivate), CRISPR / Cas9 e RNAi24,25,26. Quando questi strumenti genetici vengono utilizzati in combinazione con una potente pipeline di imaging composta da microscopia elettronica, microscopia ottica (fluorescente e non fluorescente) e imaging di animali interi come μ-CT, è possibile ottenere una valutazione approfondita di molecole, cellule, tessuti, organi e l’intero organismo, consentendo una comprensione molto più profonda della funzione genica.

Questo protocollo si concentra sull’uso della μ-CT nell’organismo modello non mammifero Drosophila melanogaster, la cui miriade di strumenti genetici hanno contribuito a chiarire numerosi meccanismi molecolari26,27. È stato adottato da protocolli precedenti in insetti non modello1,28,29,30,31,32e si basa su precedenti studi μ-CT in Drosophila per stabilire un protocollo standardizzato per il suo uso in questo animale33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Vengono delineati i passaggi per la preparazione, l’imaging e l’analisi dei campioni di successo dei set di dati μ-CT delle mosche utilizzando scanner disponibili in commercio. Con questo protocollo, tutte le fasi di sviluppo della mosca possono essere visualizzate ad alta risoluzione per studi sia descrittivi che di test di ipotesi, tra cui tassonomia, anatomia, sviluppo, fisiologia e malattia27. Questo protocollo sarà anche utile per l’imaging praticamente di qualsiasi insetto e persino di materiali non viventi che richiedono la colorazione chimica per il contrasto dell’immagine per migliorare la visualizzazione mediante μ-CT.

Protocol

1. Selezione del campione e preparazione delle cuticole Scegli il punto temporale di sviluppo appropriato (embrione, larva, pupa o adulto) per l’imaging. Per le fasi embrionali, ingabbiare le femmine su piastre di agar di succo d’uva imbrattate con pasta di lievito e raccogliere uova ogni 30-60 minuti. Lasciare che questi embrioni si sviluppino a 25 °C fino a raggiungere lo stadio corretto. Per gli stadi larvali, raccogliere il primo e il secondo instars da esperimenti di raccolta di embrioni a tempo. Scegli direttamente 3° instars erranti dal lato della fiala di cibo in condizioni di non affollamento. Per il tempismo pupale, raccogli pre-pupe bianche (spiracoli invertiti) e prendi nota del momento in cui la cuticola inizia a dorare. Gli animali progrediranno attraverso 15 fasi dello sviluppo della pupa in punti temporali definiti dopo l’imbrunimento delle cuticole e possono essere raccolti di conseguenza42. Raccogliere gli adulti come vergini dopo l’eclosione e lasciare invecchiare in una fiala alimentare per un periodo di tempo richiesto (ad esempio, 5 giorni per lo sviluppo completo dell’intestino). Trasferire 5-50 animali in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di Triton X-100 allo 0,5% in 1x Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (0,5% PBST). Mentre si picchietta periodicamente il tubo sul banco, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per aiutare nella rimozione del rivestimento idrofobo e consentire agli animali di immergersi completamente. Per gli stadi embrionale, larvale e pupale, arrestare l’ulteriore sviluppo posizionando il tubo in un blocco di calore impostato a 100 ° C per 20 s seguito da raffreddamento a RT per 5 minuti.NOTA: Gli animali possono anche essere congelati in azoto liquido37. 2. Fissazione e colorazione Rimuovere lo 0,5% di PBST e aggiungere 1 mL di soluzione bouin. Tocca il tubo per garantire che gli animali siano completamente sommersi.ATTENZIONE: Bouin’s Solution contiene formaldeide. Può causare tossicità acuta per la pelle e gli occhi se versato e può essere fatale se ingerito. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un cappotto da laboratorio durante la manipolazione.NOTA: Possono essere impiegate anche tecniche di fissazione aggiuntive, come l’uso di etanolo. I meriti di altri fissativi sono descritti in dettaglio nel rif.1,30. Per campioni di embrioni e adulti, incubare sul banco per 16-20 ore a RT. Per i campioni larvali e pupali, fissare gli animali per 2 ore a RT. Scartare la soluzione di Bouin e lavare con 1x PBS per 5 minuti tre volte. Trasferire in un piatto di dissezione multi-pozzo contenente 1x PBS e utilizzare un piccolo perno minuzioso attaccato a un supporto per praticare un foro nella cuticola anteriore e posteriore facendo attenzione a non interrompere alcun tessuto molle sottostante. Trasferire campioni larvali e pupali in un tubo di microfuga e aggiungere 1 mL di soluzione fresca di Bouin. Incubare su banco per 24 ore a RT. Rimuovere la soluzione di Bouin e lavare il campione per 30 minuti con 1 mL di tampone di lavaggio μ-CT (0,1 M Na2HPO4,1,8% saccarosio) o 1x PBS tre volte. Aggiungere 1 mL della soluzione colorante appropriata e incubare sul banco per 2-7 giorni.NOTA: la scelta della macchia dipenderà da molti fattori, ma è generalmente un equilibrio tra penetrazione, tempo di incubazione e risoluzione. In generale, l’acido fosfotungstico (PTA) fornisce un contrasto e una risoluzione superiori dei tessuti molli, ma richiede un’interruzione meccanica della cuticola e tempi di incubazione più lunghi. I pregi dei diversi tipi di macchia sono descritti in dettaglio nel rif.1. Per la colorazione dello iodio, utilizzare 1 mL di 0,1 N I2KI (Lugol Solution). Incubare per 2 giorni. Non è necessaria alcuna ulteriore interruzione della cuticola adulta. Per la colorazione dell’acido fosfotungstico (PTA), utilizzare 1 mL di una soluzione allo 0,5% (p/v) diluita in acqua. Interrompere la cuticola adulta, rimuovendo le parti della bocca o facendo dei buchi nel torace o nella cuticola addominale con un piccolo perno di minuzie attaccato a un supporto. Incubare per 5-7 giorni o più a lungo se la colorazione dei tessuti appare non omogenea. Lavare con 1 mL di acqua ultrapura o 1x PBS per 30 min. Ripetere il passaggio di lavaggio. Conservare gli animali a RT in acqua ultrapura o 1x PBS per un massimo di un mese. Se gli animali devono essere scansionati mentre sono idratati, procedere direttamente al paragrafo 4. Se è necessaria una conservazione più lunga del campione, procedere alla sezione 3 del protocollo. 3. Asciugatura del punto critico (opzionale) Eseguire una serie di disidratazione a etanolo (EtOH) sul campione: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Aggiungere 1 mL della soluzione etOH e incubare sul banco per 1 ora per ogni concentrazione nell’ordine indicato. Dopo l’ultimo ammollo 100% EtOH, sostituire con etOH fresco al 100% e lasciare incubare il campione sul banco durante la notte. Eseguire l’essiccazione dei campioni in punto critico seguendo le istruzioni del produttore.NOTA: Gli impianti di microscopia elettronica hanno generalmente una macchina per l’essiccazione del punto critico (vedi Tabella dei materiali)che eseguirà l’essiccazione del campione dopo la disidratazione dell’EtOH. 4. Montaggio del campione Per i campioni essiccati in punto critico, campioni di colla a caldo su un perno di insetto o altro supporto progettato per adattarsi al mandrino dello stadio rotante o posizionarlo in un tubo capillare di plastica o vetro (~ 1,0-1,25 mm di diametro interno). Per i campioni idratati, riempire una punta della pipetta P10 con acqua e fissare l’estremità stretta sigillando termicamente o con un film di paraffina per evitare perdite.ATTENZIONE: Assicurarsi di avvolgere saldamente le connessioni in modo che l’acqua non perda nello scanner e causi danni. Trasferire un singolo campione sulla punta della pipetta usando una pinna. Utilizzando un oggetto lungo e snello, come un ago da 20 G opaco o un’altra punta della pipetta, spingere con attenzione il campione verso il basso la punta fino a quando non contatta la parete della punta del pipetto per tenerlo in posizione. Coprire l’apertura della punta della pipetta con un film di paraffina per evitare l’evaporazione dell’acqua durante le scansioni lunghe. Montare la pipetta P10 utilizzando un supporto progettato per adattarsi al mandrino dello stadio rotante (Figura 1A-C). 5. Scansione Eseguire tutte le calibrazioni necessarie della macchina prima dell’imaging per la giornata.NOTA: questi variano a seconda del produttore e si consiglia di consultare uno specialista dell’applicazione per determinare i passaggi corretti. Si prega di consultare la Tabella dei materiali per informazioni specifiche sulla configurazione e sul software utilizzato in questo protocollo. Generalmente, calibrazioni come l’allineamento dell’asse dello stadio per rimuovere qualsiasi “oscillazione” associata al mandrino fuori asse rispetto allo stadio rotante ed eseguire correzioni a campo piatto per garantire intensità uniformi dei pixel di sfondo sulla fotocamera forniscono condizioni di imaging ottimali per la migliore risoluzione e set di dati comparabili tra più scansioni. Aprire lo sportello dello scanner per accedere al mandrino dello stadio rotante facendo clic sull’icona ‘Apri porta’ nell’angolo in alto a sinistra del software. Attaccare il campione stringendo il collare attorno alla base del portase campioni.NOTA: utilizzare una pressione delicata quando si collega il campione al mandrino rotante per mantenere l’allineamento dello scanner. Impostare i parametri di scansione nel software che controlla lo scanner per una risoluzione e un contrasto ottimali.NOTA: questi dovranno essere determinati empiricamente poiché la sorgente di raggi X, la fotocamera / rilevatore e la geometria di ciascun scanner varieranno in base al produttore. Ulteriori informazioni per selezionare i migliori parametri sono disponibili anche qui43, nonché dallo specialista delle applicazioni del produttore. Aprire il controllo di alimentazione della sorgente a raggi X (Opzioni | Sorgente di raggi X). Utilizzare le barre di scorrimento per impostare la tensione dei raggi X su 30-40 kV e la corrente su 100-110 μA per produrre un fascio di raggi X con 3-4 W di potenza e una dimensione dello spot ridotta per una maggiore risoluzione. Utilizzare la finestra di dialogo Modalità di acquisizione (Opzioni | Modalità di acquisizione) per impostare il tempo di esposizione della fotocamera a 500-800 ms. Utilizzare la barra di scorrimento situata accanto all’icona della lente di ingrandimento nella parte inferiore del software per impostare la dimensione dei pixel dell’immagine desiderata (~ 700 nm a 4 μm), a seconda delle impostazioni e della posizione della fotocamera. Questo determina il numero di immagini di proiezione che vengono acquisite durante la scansione, con più proiezioni che portano a una risoluzione migliorata ma tempi di scansione più lunghi (vedere Risultati rappresentativi). Fare clic e trascinare la barra di scorrimento situata accanto alla freccia rotante nella parte inferiore del software per spostare il campione lungo il percorso di rotazione a 360 °. Assicurarsi che l’esempio rimanga all’interno del campo visivo. Fare clic sull’icona’Avvia acquisizione'(icona a forma di freccia circolare blu) nella parte superiore del software. Viene visualizzata una finestra di dialogo che consente di impostare parametri di scansione aggiuntivi e di nominare il file e la cartella di output in cui verrà salvata la scansione. Imposta il movimento casuale su 10 e una media di 4-6 fotogrammi. La fase di rotazione viene calcolata automaticamente in base alle impostazioni della telecamera utilizzate. Inizia la scansione facendo clic su ‘OK’ nella finestra di dialogo Acquisizione. Viene visualizzata una seconda finestra di dialogo della barra di avanzamento che mostra il tempo di scansione. Lo scanner acquisirà ora una serie di immagini di proiezione (Figura 1D) del campione lungo il percorso di rotazione e non ha bisogno di essere monitorato. 6. Ricostruzione Per generare i tomogrammi, eseguire la ricostruzione dell’immagine utilizzando le immagini di proiezione.NOTA: Mentre quasi tutte le ricostruzioni di immagini da scanner geometrici a fascio cono si basano sull’algoritmo Feldkamp16,i singoli parametri variano a seconda dell’implementazione del software e devono essere determinati empiricamente. Le seguenti impostazioni, specifiche per un software disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)possono essere utilizzate come guida. Parametri come la compensazione del disallineamento, la riduzione dell’artefatto dell’anello e la correzione dell’indurimento del fascio (0% per la maggior parte dei campioni di mosca) vengono eseguiti in modo iterativo per scegliere i valori migliori per la ricostruzione finale. Per gli utenti esperti che desiderano un maggiore controllo sul processo di ricostruzione, vedere l’interfaccia MATLAB qui44. Eseguire un allineamento iniziale dell’immagine utilizzando un algoritmo di correzione dello spostamento basato sulle scansioni di riferimento45 (Azioni | Allineamento X/Y con scansione di riferimento). Ottimizza ogni parametro di ricostruzione (Start | Messa a punto). In questo modo viene attivata una finestra di dialogo “Ottimizzazione dei parametri”. Ottimizza l’allineamento facendo clic su ‘Avanti’ a ‘Post-allineamento’. Impostare il numero di iterazioni su cinque e il passaggio del parametro su 1.0. Fare clic sul pulsante Start per generare una serie di anteprime. Selezionare l’immagine correttamente allineata.NOTA: un’immagine correttamente allineata non sarà sfocata o visualizzerà artefatti di “taglio” in cui appare divisa una struttura altrimenti continua (come la cuticola). Ottimizza la riduzione dell’artefatto dell’anello facendo clic accanto ad esso. Impostare il numero di iterazioni su cinque e il passaggio del parametro su 1.0. Fare clic sul pulsante Start per generare una serie di anteprime. Selezionare l’immagine che contiene il minor numero di anelli. Una volta che i parametri di cui sopra sono stati ottimizzati per dare l’immagine migliore, assicurarsi che i valori selezionati siano rappresentati correttamente nella scheda Impostazioni (Impostazioni). Regola i valori finali di luminosità e contrasto utilizzando l’istogramma, i parametri del file come la profondità di bit e il tipo e utilizza una regione di interesse (ROI) che comprende solo le strutture di interesse (ad esempio, solo l’intera mosca o la testa) per ridurre il tempo di calcolo(Output). Inizia la ricostruzione (Start | Inizio). Se sono necessarie più ricostruzioni, aggiungere l’immagine corrente al gestore batch (Start | Aggiungi al batch) e ripetere i passaggi 6.2-6.5 per le immagini rimanenti. 7. Analisi delle immagini Visualizza i tomogrammi in due e tre dimensioni ed esegui ulteriori analisi morfometriche con software freeware o commerciale.NOTA: I dettagli del software utilizzato in questo protocollo sono disponibili nella Tabella dei materiali. Altri pacchetti software in grado di valutare set di dati μ-CT includono opzioni freeware come FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48, oltre a software commerciale (ad esempio, AMIRA). Altre applicazioni che impiegano algoritmi basati sull’apprendimento automatico per semi-automatizzare il processo di segmentazione possono aiutare a velocizzare i flussi di lavoro e ridurre i pregiudizi umani (ad esempio, Biomedisa49). Importare il file del tomogramma nel software (File | Importa file immagine). I metadati associati al file dovrebbero caricarsi automaticamente nella finestra, ma possono anche essere impostati manualmente per corrispondere alle proprietà dell’immagine. Per segmentare una struttura di interesse, fai clic sulla scheda Segmento sul lato sinistro dello schermo. Creare una nuova regione di interesse (ROI)(| di base Nuovo), dargli un nome e selezionare un colore appropriato. Definire l’intervallo di soglia che comprende la struttura di interesse (Intervallo | Definisci intervallo) utilizzando la barra di scorrimento. Selezionare una modalità di pittura ROI 2D o 3D appropriata (ROI Painter | Opzione pennello). Per dipingere un’area definita dalla soglia; tenere premuto il tasto Ctrl tenendo premuto il tasto sinistro del mouse. Per rimuovere un’area, tieni premuto il tasto Maiusc mentre tieni premuto il tasto sinistro del mouse.NOTA: per modificare le dimensioni del pennello circolare o quadrato, è sufficiente scorrere la rotellina del mouse tenendo premuti i tasti Ctrl o Maiusc. Continua a dipingere la struttura di interesse in tutto il suo volume Z. Convertire il ROI in una mesh (Export | A un | mesh Normale). Evidenziare la sovrapposizione mesh facendo clic su di essa nel pannello Proprietà dati e impostazioni nell’angolo in alto a destra. Lisciare la mesh utilizzando un numero appropriato di iterazioni (Smooth Mesh | Iterazioni).NOTA: utilizzare lo stesso valore di iterazione di smussatura mesh per tutte le immagini da confrontare. Assicuratevi che le misurazioni del ROI della mesh(Superficie, Volume e Diametro Feret)siano visualizzate nel pannello Informazioni sul lato destro dello schermo per l’analisi morfometrica di base. Ulteriori analisi possono essere eseguite utilizzando il modulo di analisi degli oggetti. Eseguite il rendering dell’oggetto mesh e dell’intera immagine del tomogramma e visualizzate in 3D. Utilizzare Movie Maker integrato per generare un video dell’oggetto (fare clic con ilpulsante destro del mouse | Mostra Movie Maker) utilizzando singoli fotogrammi dal visualizzatore (Aggiungi chiave).NOTA: diversi miglioramenti visivi possono essere applicati anche al filmato utilizzando la scheda Effetti visivi nel pannello di destra per evidenziare determinate funzionalità, ecc. Esporta il video per la visualizzazione utilizzando il pulsante Esporta animazione in Movie Maker.

Representative Results

La Figura 2 mostra le immagini di un embrione, 3larve di instar, pupe allo stadio adulto di farato (P7) e una mosca femmina adulta macchiata di iodio e ettarata in acqua utilizzando uno scanner da banco commerciale. L’eccellente conservazione e persino la colorazione del tessuto delicato sono evidenti, consentendo a tutti i principali organi di essere facilmente identificati e utilizzati per l’analisi morfometrica e la visualizzazione 3D. In genere, le scansioni che acquisiscono meno immagini di proiezione del campione forniscono una risoluzione inferiore rispetto alle scansioni che acquisiscono più immagini di proiezione, con il compromesso che è il tempo trascorso nella scansione. Sebbene i tempi di scansione varino in base allo strumento e ad altri parametri di scansione, le scansioni che acquisiscono alcune centinaia di proiezioni (~ 3 μm di dimensione pixel dell’immagine) richiedono circa 30 minuti per campione, mentre le scansioni costituite da migliaia di immagini di proiezione (700 nm-1,25 μm di dimensione pixel dell’immagine) possono richiedere 8-16 ore. Un confronto tra la stessa testa di mosca adulta presa in modalità di scansione sia “lenta” (migliaia di proiezioni) che “veloce” (centinaia di proiezioni) è mostrata nella Figura 3. È importante sottolineare che le analisi morfometriche non differiscono tra scansioni “lente” e “veloci”(Figura 3C)40. La nostra pipeline di imaging, quindi, utilizza scansioni veloci per generare una dimensione del campione sufficientemente grande per l’analisi morfometrica e scansioni lente per visualizzare eventuali difetti morfologici o anatomici a una risoluzione più elevata. Utilizzando il software (Step 7), qualsiasi tessuto o sistema di organi di interesse può essere segmentato e utilizzato per l’analisi morfometrica e visualizzato in 3D utilizzando il movie maker (Movie 1). La Figura 4 mostra un esempio dell’addome della mosca macchiato con PTA e ripreso idratato (acqua) o dopo l’essiccazione del punto critico (CPD) su un microscopio a raggi X (Table of Materials). Il dettaglio offerto da una combinazione del PTA e delle capacità di questa piattaforma è facilmente evidente in queste immagini, in modo tale che le singole cellule epiteliali del midgut e i fasci di spermatozoi all’interno dei testicoli siano facilmente risolvibili. Mentre l’immagine CPD mostra una risoluzione leggermente aumentata rispetto al campione idratato, una migliore conservazione dell’ultrastruttura dei tessuti delicati (come le cellule adipose vicino alla cuticola) si ottiene con campioni idratati (Film 2). Figura 1: Panoramica della progettazione dello scanner e del montaggio del campione per μ-CT. (A) Uno scanner μ CT da banco commerciale. (B) Vista all’interno dello scanner. La sorgente di raggi X (a destra) emette raggi X che passano attraverso il campione situato su uno stadio rotante (freccia gialla). L’attenuazione di questi raggi X genera il contrasto dell’immagine mentre passano attraverso il campione e sul rivelatore, che consiste in uno schermo a scintillazione che converte i raggi X in fotoni e una fotocamera CCD standard (a sinistra). (C) Montaggio di un moscerino della frutta adulto per immagini idratate in acqua. I punti di connessione tra la punta della pipetta e il supporto in ottone sono avvolti in un film di paraffina per evitare perdite e potenziali danni allo scanner. Anche il mandrino del palco è evidenziato. Si noti che la punta della pipetta è stata posizionata leggermente fuori asse, il che ha portato a un tempo di scansione più lungo e a una risoluzione ridotta nella ricostruzione finale. (D) Una singola immagine di proiezione 2D di una mosca femmina adulta; centinaia o migliaia di queste proiezioni vengono acquisite durante una scansione lungo l’asse di rotazione e vengono utilizzate per la ricostruzione per generare tomogrammi contenenti risoluzione isotropa e informazioni 3D accurate. Barre di scala (C) = 2 mm. P, posteriore; V, Ventrale. Questa cifra è stata modificata da Schoborg et al.40. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Tutte le fasi del ciclo di vita di Drosophila melanogaster, immagini da μ-CT. Campioni colorati con iodio e ripresi idratati in acqua. Viene mostrata una singola sezione 2D. (A) Un embrione che ha completato le prime fasi della gastrulazione (asterisco). (B) Una terza larva instar. (C) Un adulto di farato P7 durante la metamorfosi. (D) Una femmina adulta. Vari organi sono evidenziati: BWM, muscoli della parete corporea; Br, cervello; Cd, cardia; Cr, raccolto; DLM, muscoli longitudinali dorsali; DVM, muscoli ventrali dorsali; E-AD, disco oculare-antennale; Em, embrione; FB, corpi grassi; FBC, cellule del corpo adiposo; H, cuore; Hg, intestino posteriore; La, lamina; L, gamba; Mg, midgut; OL, lobo ottico cerebrale; Ov, ovopositore; PC, cuticola pupale; SG, ghiandole salivari; VNC, cordone nervoso ventrale; W, ala; WD, disco alare. Barre di scala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsale; A, Anteriore; L, Sinistra. Parametri di scansione: Distanza da sorgente a campione (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Dimensione pixel della fotocamera (μm): (A-D) 11.6. Dimensione pixel immagine (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: I parametri di scansione e la risoluzione dell’immagine non alterano le analisi morfometriche. Una testa adulta scansionata utilizzando entrambe le impostazioni dello scanner(A, A’),”veloci” (centinaia di proiezioni) e(B, B’)”lente” (migliaia di proiezioni). Il cervello è delineato in giallo. (C) Misurazioni del volume cerebrale da scansioni lente e veloci. Strutture in evidenza: AL; lobo antennale; CB, cervello centrale; FB, corpo a forma di ventaglio; FCs, cellule adipose; La, lamina; Lo, lobula; LoP, piastra di lobula; Io, midollo; Re, retina. n = 5, t-test di Welch. ns = non significativo. Barre di scala = 100 μm. Parametri di scansione: Distanza dalla sorgente al campione (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A) 348 (B) 350. Dimensione pixel della fotocamera (μm): (A-B) 11.6. Dimensione pixel immagine (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Questa cifra è stata modificata da Schoborg et al.40. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Addome di Drosophila melanogaster ripreso dalla microscopia a raggi X. Gli addominali sono stati colorati con lo 0,5% di PTA e ripresi idratati (acqua) o dopo l’essiccazione del punto critico (CPD). (A) Punto critico Addome essiccato, mostrato dalla prospettiva YZ e (A’) XZ prospettiva. (B) Addome idratato, mostrato dalla prospettiva YZ e (B’) prospettiva XZ. Vari organi sono evidenziati: FC, cellule adipose; Hg, intestino posteriore; Mg, Midgut; SP, Pompa dello sperma; Te, Testicoli. Barre di scala (A) = 250 μm. D, dorsale; A, Anteriore; L, Sinistra. Parametri di scansione: Distanza dalla sorgente al campione (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Obiettivo: (A-B) 4X. Dimensione pixel immagine (μm): (A-B) 0,65. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Film 1: Una terza larva instar, resa in 3D usando il Movie Maker in Dragonfly. Gli organi evidenziati includono il cervello (giallo), i dischi immaginali occhio-antennale (rosso), il corpo grasso (blu) e i muscoli della parete corporea (verde). Clicca qui per scaricare questo film. Filmato 2: Confronto di campioni ripresi in acqua o dopo l’essiccazione del punto critico. Vengono mostrati addominali macchiati con 0,5% di PTA. Entrambi gli addominali sono stati scansionati con impostazioni identiche delle dimensioni dei pixel dell’immagine (0,65 μm). Una serie di fette 2D sono mostrate in un formato “Z-stack” (YZ) che inizia dalla superficie dorsale e termina sulla superficie ventrale dell’addome. Organi evidenziati: FC, cellule adipose; Mg, Midgut; SP, Pompa dello sperma; Te, Testicoli. Parametri di scansione: Distanza dalla sorgente al campione (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distanza dalla sorgente alla fotocamera (mm): (A) 28 (B) 29.5. Obiettivo: (A-B) 4X. Dimensione pixel immagine (μm): (A-B) 0,65. Clicca qui per scaricare questo film.

Discussion

Visualizzare la Drosophila melanogaster intatta in tutte le fasi dello sviluppo è rimasta una sfida, principalmente a causa dell’incompatibilità della microscopia ottica con la cuticola spessa e pigmentata che si trova in questo animale. Mentre altri metodi di imaging di animali interi, come la risonanza magnetica (MRI), la tomografia a coerenza ottica (OCT) e l’ultramicroscopia accoppiata con la pulizia dei tessuti sono stati utilizzati con successo nelle mosche50,51, 52,53,54,μ-CT presenta una serie di vantaggi che lo rendono ideale per l’imaging di animali interi di questo organismo13,15,30 . I raggi X penetrano facilmente nella cuticola pigmentata e la loro piccola lunghezza d’onda consente l’imaging sub-micron. L’etichettatura richiede un investimento minimo in sostanze chimiche ampiamente disponibili e nessuna competenza da banco specializzata13. μ scanner ct sono anche disponibili in commercio e i costi sono paragonabili alle piattaforme di microscopia ottica, pur essendo più attraenti per una più ampia gamma di discipline (geologia, paleontologia, ingegneria, ecc.) che possono anche beneficiare della sua disponibilità presso un’istituzione. Le sorgenti di raggi X di sincrotrone possono anche essere utilizzate per l’imaging μ-CT ad alta risoluzione di insetti fissi e viventi31,55,56,ma sono meno accessibili degli scanner da banco commerciali.

Questo protocollo fornisce un modo efficiente per ottenere immagini μ-CT di adulti mosca, pupe, larve ed embrioni cellularizzati. Si noti che per molti dei passaggi descritti sopra, è possibile applicare anche metodi alternativi per preparare i campioni per l’imaging. Altri studi hanno fornito un confronto dettagliato di diverse fasi di fissazione, etichettatura e asciugatura per l’uso negli insetti e coloro che sono interessati ad adottare questa tecnica sono incoraggiati a valutare i meriti di ciascun approccio1,4,13,29,30,57. Mentre questo protocollo è relativamente semplice, vengono presentati alcuni suggerimenti utili.

In primo luogo, è necessario prestare attenzione quando si interrompe la cuticola di campioni intatti in modo tale che i tessuti molli sottostanti non vengano interrotti in modo significativo. È importante lasciare che le fasi larvali e le prime fasi pupali subiscano la fissazione per 2 ore nella soluzione di Bouin prima di colpire. Ciò irrigidisce il tessuto e limita la quantità di emolinfa che trasuda dai fori delle cuticole, che possono alterare l’architettura degli organi. I singoli segmenti del corpo (testa, torace e addome) dell’adulto possono essere separati se le strutture di interesse si trovano lì. Si consiglia di utilizzare un bisturi per tagliare in modo pulito questi segmenti piuttosto che separarli con una pinze, che potrebbero interrompere l’architettura 3D dell’intestino o del sistema nervoso centrale, per esempio. Per quanto riguarda i tempi, gli adulti hanno generalmente bisogno solo di 16 ore. per la fissazione completa, mentre gli stadi larvale e pupale necessitano di 24 ore. Inoltre, se la colorazione di iodio o PTA appare irregolare, il campione può essere rimesso in soluzione per incubare più a lungo fino a raggiungere una colorazione uniforme. Infine, i campioni idratati non devono essere posizionati a 4 °C, in quanto ciò sembra indurre la formazione di bolle d’aria all’interno della cavità corporea dopo il riscaldamento a temperatura ambiente.

In secondo luogo, il montaggio del campione varia in base allo strumento, al tipo di stadio e se il campione deve rimanere idratato o è stato asciugato dal punto critico. Se idratato, assicurarsi che il campione non perda ed eventualmente distrugga lo scanner. Quando si monta il campione all’interno di una punta della pipetta, assicurarsi di spingere delicatamente con un oggetto opaco fino a quando i campioni incontrano una leggera resistenza e non possono muoversi. Spingere troppo forte può portare a deformazioni della cuticola e difetti strutturali sottostanti. Inoltre, assicurarsi che il campione sia allineato nel supporto il più vicino possibile all’asse di rotazione. Qualsiasi oscillazione aumenterà i tempi di scansione a causa del campo visivo più ampio e ridurrà la risoluzione del tomogramma finale dopo la ricostruzione.

In terzo luogo, le impostazioni dello scanner per l’acquisizione di immagini di proiezione variano anche in base allo strumento. Per massimizzare le capacità di risoluzione dello scanner, la dimensione dello spot del fascio di raggi X deve essere la più piccola possibile (5-10 μm). Ciò può essere ottenuto bilanciando la tensione a raggi X e le impostazioni di corrente in modo tale che la potenza totale sia di 3-4 W. Con queste impostazioni e il tempo di esposizione appropriato sulla fotocamera, è possibile ottenere una corretta attenuazione del fascio di raggi X da parte del campione e un contrasto ottimale dell’immagine. L’uso di filtri in alluminio o rame tra l’oggetto e la sorgente di raggi X può essere utilizzato per mettere a punto le impostazioni ottimali dell’energia dei raggi X per il miglior contrasto dell’immagine o attenuare il fascio sufficientemente per utilizzare sorgenti di potenza superiore. Per quanto riguarda la risoluzione dell’immagine, questa dipenderà da molte variabili diverse, tra cui il tipo di macchia, il numero di immagini di proiezione, la dimensione dei pixel dell’immagine, la posizione della fotocamera, il movimento del campione, le vibrazioni dello scanner e i parametri di ricostruzione. Un modello di barra fantasma (QRM GmbH) contenente marcatori di dimensioni note può aiutare a valutare la risoluzione spaziale per una determinata impostazione dello scanner e della fotocamera.

Vale anche la pena valutare i meriti dell’imaging di campioni secchi o idratati a punto critico. Sombke et al. hanno eseguito una valutazione comparativa dei due metodi e hanno trovato l’essiccazione del punto critico superiore per le applicazioni μ-CT che coinvolgono artropodi30. Tuttavia, i benefici dei campioni idratati sono che gli animali sono soggetti a una minore esposizione chimica e meccanica che potrebbe portare a manufatti sia quantitativi che morfologici. Questo tende anche a preservare i tessuti delicati meglio della CPD. Tuttavia, i campioni idratati hanno una durata di conservazione molto più breve e dovrebbero essere ripresi entro e non oltre un mese dalla fissazione poiché la degradazione dei tessuti e la ridotta qualità dell’immagine diventano evidenti a quel punto. Inoltre, la risoluzione dei campioni idratati sarà leggermente inferiore a quella di un campione essiccato al punto critico, perché i raggi X devono penetrare anche attraverso una punta di pipetta di plastica e il liquido circostante (acqua o tampone). Punto critico I campioni essiccati possono essere conservati per periodi di tempo molto più lunghi, specialmente se conservati su Drierite. Possono anche essere posizionati direttamente nel percorso del fascio di raggi X semplicemente incollando le ali o le gambe a un perno di insetto e posizionandolo nel mandrino del palco, semplificando il processo di montaggio. Tuttavia, l’estesa disidratazione dell’etanolo di questi campioni può portare al restringimento dei tessuti e alla perdita di un’architettura tissutale delicata, motivo per cui è importante eseguire una serie di concentrazioni crescenti di EtOH per ridurre al minimo questi effetti. Tuttavia, va notato che tutte le forme di trattamento chimico, compresa la fissazione della paraformaldeide e persino la colorazione dello iodio possono causare restringimento dei tessuti58,59. Mentre nessuno dei due metodi fornirà misurazioni delle “dimensioni effettive dell’organo” in una mosca vivente, le misurazioni morfometriche sono ancora valide quando si confrontano animali mutanti e wildtype purché le fasi di fissazione, colorazione e asciugatura siano eseguite in modo identico per entrambe le serie di campioni, preferibilmente in parallelo.

In conclusione, μ-CT fornisce un utile strumento di imaging di animali interi per Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Molti altri studi hanno mostrato il potere di questa tecnologia per comprendere vari aspetti della tassonomia degli insetti, dell’ecologia, della fisiologia, dello sviluppo e dell’anatomia che possono aiutare a informare gli studi futuri sulle mosche1,28,30,31,32,55,56,57 . In combinazione con gli strumenti di microscopia genetica e leggera già ampiamente utilizzati in questo organismo, μ-CT può posizionarsi all’interno di una pipeline sperimentale che consente una comprensione più profonda tra genotipo e fenotipo.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Niente di tutto questo sarebbe stato possibile senza il sostegno di Nasser Rusan. Vorrei ringraziare H. Doug Morris, Danielle Donahue e Brenda Klaunberg del NIH Mouse Imaging Facility e Ben Ache di Micro Photonics per la formazione e l’utile discussione. Ringrazio anche Mansoureh Norouzi Rad di Zeiss per aver scansionato campioni di addome su Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith e Rachel Ng hanno anche aiutato con la scansione. Mike Marsh di Object Research Systems ha fornito supporto tecnico a Dragonfly. Sono anche grato per il sostegno del National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) e dei fondi start-up dell’Università del Wyoming. Ringrazio anche i revisori anonimi per i loro utili suggerimenti e commenti.

Materials

100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)
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Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).
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