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概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
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発生生物学

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

Published: September 02, 2020
doi:
10.3791/61515
1Department of Molecular Biology,University of Wyoming

概要

Un protocole est présenté qui permet la visualisation de Drosophila melanogaster intact à n’importe quel stade de développement à l’aide de la tomographie microcalculée.

Abstract

Les outils d’imagerie biomédicale permettent d’enquêter sur les mécanismes moléculaires à travers les échelles spatiales, des gènes aux organismes. Drosophila melanogaster, un organisme modèle bien caractérisé, a bénéficié de l’utilisation de la microscopie optique et électronique pour comprendre la fonction des gènes au niveau des cellules et des tissus. L’application de plateformes d’imagerie qui permettent de comprendre la fonction des gènes au niveau de l’ensemble de l’organisme intact améliorerait encore nos connaissances sur les mécanismes génétiques. Ici, une méthode d’imagerie animale complète est présentée qui décrit les étapes nécessaires pour visualiser la drosophile à n’importe quel stade de développement à l’aide de la microtographie par micro-ordinateur (μ-CT). Les avantages de μ-CT comprennent une instrumentation disponible dans le commerce et un temps pratique minimal pour produire des informations 3D précises à une résolution au micron sans avoir besoin de méthodes de dissection tissulaire ou de nettoyage. Associée à un logiciel qui accélère l’analyse d’images et le rendu 3D, une analyse morphométrique détaillée de tout tissu ou système organique peut être effectuée pour mieux comprendre les mécanismes de développement, de physiologie et d’anatomie pour les études descriptives et de test d’hypothèses. En utilisant un flux de travail d’imagerie qui intègre l’utilisation de la microscopie électronique, de la microscopie optique et de la μ-CT, une évaluation approfondie de la fonction des gènes peut être effectuée, renforçant ainsi l’utilité de ce puissant organisme modèle.

Introduction

Les méthodes d’imagerie qui permettent l’étude détaillée des structures intérieures d’un objet sans détruire son architecture 3D globale se sont avérées largement bénéfiques pour un certain nombre de disciplines différentes, notamment la physique, l’ingénierie, la science des matériaux, l’archéologie, la paléontologie, la géologie et la biologie1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Parmi ces méthodes d’imagerie non destructive, les plates-formes à base de rayons X sont particulièrement utiles en raison de la capacité des rayons X à haute énergie à pénétrer dans de nombreux types d’échantillons et de matériaux différents avec une diffusion minimale par rapport aux ondes lumineuses visibles. La tomodensitométrie (CT), la microtrétographie (μ-CT), la nanotographie par calcul (Nano-CT) et la microtomographie synchrotron sont donc apparues comme les principales technologies pour l’imagerie par rayons X d’échantillons allant des mètres aux microns, avec des capacités de résolution millimétrique à submicronique10,11,12,13,14.

Bien que ces plates-formes diffèrent par leur conception, leur géométrie des rayons X et leurs composants afin d’équilibrer la taille et la résolution de l’échantillon, elles reposent toutes sur le même principe de base pour la capture d’images: une source de rayons X qui traversent l’objet et sont capturés par un détecteur. L’atténuation différentielle du faisceau de rayons X lorsqu’il traverse des densités variables dans l’objet génère un contraste d’image. Les données 3D sont obtenues en faisant pivoter l’échantillon ou le détecteur, en collectant une série d’images de projection 2D qui sont ensuite reconstruites à l’aide d’algorithmes en tomogrammes contenant des informations 3D dont la résolution est isotrope en x,y,z15. Pour de nombreux scanners μ-CT de paillasse qui utilisent une géométrie de rayons X à faisceau conique pour projeter des rayons X sur l’objet imagé, l’algorithme de Feldkamp est utilisé pour reconstruire avec précision l’objet avec un minimum d’erreurs16.

La résolution d’une plate-forme donnée est déterminée principalement par des paramètres du système tels que la taille du faisceau de rayons X (taille du point), la géométrie du scanner (distance de l’objet à la source de rayons X), la taille des pixels sur le détecteur et l’algorithme de reconstruction utilisé. D’autres facteurs, tels que les vibrations du scanner, les fluctuations du faisceau de rayons X, le mouvement de l’échantillon et le type de matériau ou la tache chimique utilisée pour visualiser l’objet peuvent également influencer de manière significative la résolution spatiale dans des conditions d’imagerie réelles15.

Pour les applications biomédicales, la tontimétrie et la tot-μ ont joué un rôle clé dans l’avancement de notre compréhension de l’anatomie, de la physiologie, du développement et des mécanismes de la maladie, servant d’outil pour les diagnostics des patients humains et de plate-forme d’imagerie préclinique pour les organismesmodèles 17,18. Par exemple, le Mouse International Phenotyping Consortium, dont l’objectif est d’identifier la fonction de chaque gène du génome de la souris, utilise μ-CT dans le cadre de son pipeline de phénotypage19. Leurs résultats ont été essentiels pour comprendre les gènes impliqués dans le développement et les processus pathologiques, tout en servant d’atlas pour l’anatomie et le développement de la souris20. D’autres organismes modèles, tels que le poisson-zèbre et le rat, ont également pleinement adopté l’utilisation de la μ-CT pour effectuer le phénotypage animal entier d’un certain nombre de mutants génétiques17,21,22,23.

L’avantage de combiner l’imagerie d’animaux entiers avec des organismes modèles est qu’une compréhension mécaniste de la fonction des gènes pour un processus biologique donné peut être pleinement explorée. Cela est possible grâce aux génomes bien caractérisés et aux nombreux outils génétiques disponibles dans les organismes modèles qui permettent une manipulation précise de la fonction des gènes à des moments de développement distincts, des tissus spécifiques, des cellules individuelles et même des organites subcellulaires. Ceux-ci incluent des systèmes d’expression binaire tels que le système UAS/GAL4 (et ses nombreux dérivés), CRISPR/Cas9, et l’ARNi24,25,26. Lorsque ces outils génétiques sont utilisés en conjonction avec un puissant pipeline d’imagerie composé de microscopie électronique, de microscopie optique (fluorescente et non fluorescente) et d’imagerie animale entière telle que la μ-CT, une évaluation approfondie des molécules, des cellules, des tissus, des organes et de l’organisme entier peut être réalisée, ce qui permet une compréhension beaucoup plus approfondie de la fonction des gènes.

Ce protocole se concentre sur l’utilisation de μ-CT dans l’organisme modèle non mammifère Drosophila melanogaster, dont la myriade d’outils génétiques ont permis d’élucider de nombreux mécanismes moléculaires26,27. Il a été adopté à partir de protocoles antérieurs chez des insectes non modèles1,28,29,30,31,32, et s’appuie sur des études μ-CT antérieures chez la drosophile pour établir un protocole normalisé pour son utilisation chez cet animal33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Les étapes de la préparation, de l’imagerie et de l’analyse réussies des ensembles de données de μ-CT à l’aide de scanners disponibles dans le commerce sont décrites. Avec ce protocole, tous les stades de développement de la mouche peuvent être visualisés à haute résolution pour les études descriptives et les études de test d’hypothèses, y compris la taxonomie, l’anatomie, le développement, la physiologie et la maladie27. Ce protocole sera également utile pour l’imagerie de pratiquement tous les insectes et même des matériaux non vivants qui nécessitent une coloration chimique pour le contraste de l’image afin d’améliorer la visualisation par μ-CT.

Protocol

1. Sélection de l’échantillon et préparation des cuticules Choisissez le point temporel de développement approprié (embryon, larve, nymphe ou adulte) pour l’imagerie. Pour les stades embryonnaires, les femelles en cage sur des assiettes de gélose de jus de raisin enduites de pâte de levure et collectent les œufs toutes les 30 à 60 minutes. Laissez ces embryons se développer à 25 °C jusqu’à ce que le stade approprié soit atteint. Pour les stades larvaires, collectez les première et deuxième instars à partir d’expériences de collecte d’embryons chronométrées. Choisissez directement les 3e étoiles errantes du côté du flacon de nourriture dans des conditions de non-encombrement. Pour le chronométrage des nymphes, collectez les pré-pupes blanches (spiracles inversés) et notez le moment où la cuticule commence à brunir. Les animaux progresseront à travers 15 étapes de développement nymphal à des moments définis après le brunissement des cuticules et peuvent être collectés en conséquence42. Recueillir les adultes en tant que vierges après l’eclosion et laisser vieillir dans un flacon de nourriture pendant un laps de temps requis (par exemple, 5 jours pour un développement intestinal complet). Transférer 5 à 50 animaux dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de Triton X-100 à 0,5 % dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (0,5 % de PBST). Tout en tapotant périodiquement le tube sur la paillasse, incuber pendant 5 minutes à température ambiante (RT) pour aider à l’élimination du revêtement hydrophobe et permettre aux animaux de s’immerger complètement. Pour les stades embryonnaire, larvaire et nymphal, arrêtez le développement ultérieur en plaçant le tube dans un bloc thermique réglé à 100 °C pendant 20 s, suivi d’un refroidissement à RT pendant 5 min.REMARQUE: Les animaux peuvent également être congelés dans de l’azote liquide37. 2. Fixation et coloration Retirer 0,5 % de PBST et ajouter 1 mL de solution de Bouin. Tube de robinet pour s’assurer que les animaux sont complètement submergés.ATTENTION : La solution de Bouin contient du formaldéhyde. Il peut causer une toxicité aiguë pour la peau et les yeux s’il est renversé et peut être mortel s’il est avalé. Portez des gants, des lunettes de sécurité et un manteau de laboratoire lors de la manipulation.REMARQUE: Des techniques de fixation supplémentaires peuvent également être utilisées, telles que l’utilisation d’éthanol. Les mérites des autres fixateurs sont décrits en détail dans les réf.1,30. Pour les échantillons embryonnaires et adultes, incuber sur la paillasse pendant 16-20 h à RT. Pour les échantillons larvaires et nymphaux, fixez les animaux pendant 2 h à TA. Jetez la solution de Bouin et lavez-les avec 1x PBS pendant 5 min trois fois. Transférer dans un plat à dissection multi-puits contenant 1x PBS et utiliser une petite broche de minutie attachée à un support pour percer un trou dans la cuticule antérieure et postérieure en prenant soin de ne pas perturber les tissus mous sous-jacents. Transférer les échantillons larvaires et nymphaux dans un tube de microfuge et ajouter 1 mL de solution fraîche de Bouin. Incuber sur paillasse pendant 24 h à RT. Retirer la solution de Bouin et laver l’échantillon pendant 30 min avec 1 mL de tampon de lavage μ-CT (0,1 M Na2HPO4,1,8 % de saccharose) ou 1x PBS trois fois. Ajouter 1 mL de la solution de coloration appropriée et incuber sur la paillasse pendant 2 à 7 jours.REMARQUE: Le choix de la coloration dépendra de nombreux facteurs, mais il s’agit généralement d’un équilibre entre la pénétration, le temps d’incubation et la résolution. En général, l’acide phosphotungstique (PTA) offre un contraste et une résolution supérieurs des tissus mous, mais nécessite une perturbation mécanique de la cuticule et des temps d’incubation plus longs. Les mérites des différents types de taches sont décrits en détail dans la réf.1. Pour la coloration à l’iode, utilisez 1 mL de 0,1 N I2KI (solution de Lugol). Incuber pendant 2 jours. Aucune autre perturbation de la cuticule adulte n’est nécessaire. Pour la coloration à l’acide phosphotungstique (PTA), utilisez 1 mL d’une solution à 0,5 % (p/v) diluée dans de l’eau. Perturbez la cuticule adulte, soit en retirant les pièces buccales, soit en perçant des trous dans le thorax ou la cuticule abdominale avec une petite épingle à minutie attachée à un support. Incuber pendant 5 à 7 jours ou plus si la coloration tissulaire semble non homogène. Laver avec 1 mL d’eau ultrapure ou 1x PBS pendant 30 min. Répétez l’étape de lavage. Conservez les animaux à RT dans de l’eau ultrapure ou 1x PBS pendant un mois. Si les animaux doivent être scannés pendant qu’ils sont hydratés, passez directement à la section 4. Si une conservation plus longue de l’échantillon est nécessaire, passez à la section 3 du protocole. 3. Séchage des points critiques (facultatif) Effectuer une série de déshydratation à l’éthanol (EtOH) sur l’échantillon: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Ajouter 1 mL de la solution d’EtOH et incuber sur la paillasse pendant 1 h pour chaque concentration dans l’ordre indiqué. Après le dernier trempage 100% EtOH, remplacer par 100% EtOH frais et laisser l’échantillon incuber sur la paillasse pendant la nuit. Effectuez le séchage des points critiques des échantillons en suivant les instructions du fabricant.REMARQUE: Les installations de microscopie électronique disposent généralement d’une machine de séchage des points critiques (voir tableau des matériaux)qui effectuera le séchage de l’échantillon après la déshydratation de l’EtOH. 4. Montage de l’échantillon Pour les échantillons séchés à point critique, des échantillons de colle chaude sur une épingle à insectes ou un autre support conçu pour s’insérer dans le mandrin de l’étage rotatif ou le placer dans un tube capillaire en plastique ou en verre (~ 1,0-1,25 mm de diamètre intérieur). Pour les échantillons hydratés, remplissez d’eau une pointe de pipette P10 et fixez l’extrémité étroite par thermoscellage ou par un film de paraffine pour éviter les fuites.ATTENTION : Assurez-vous d’envelopper hermétiquement les connexions afin que l’eau ne s’infiltre pas dans le scanner et ne cause pas de dommages. Transférer un seul échantillon à l’extrémité de la pipette à l’aide d’une pince. À l’aide d’un objet long et mince, comme une aiguille émoussée de 20 G ou une autre pointe de pipette, poussez soigneusement l’échantillon vers le bas de la pointe jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la paroi de la pointe de la pipette pour le maintenir en place. Couvrir l’ouverture de l’embout de la pipette avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation de l’eau lors de longs scans. Montez la pipette P10 à l’aide d’un support conçu pour s’insérer dans le mandrin de l’étage rotatif(Figure 1A-C). 5. Numérisation Effectuez tous les étalonnages nécessaires de la machine avant l’imagerie pour la journée.REMARQUE: Ceux-ci varient selon le fabricant et il est recommandé de consulter un spécialiste de l’application pour déterminer les étapes appropriées. Veuillez consulter le Tableau des matériaux pour obtenir des informations spécifiques sur la configuration et le logiciel utilisés dans ce protocole. En règle générale, les étalonnages tels qu’un alignement d’axe de scène pour éliminer tout « vacillement » associé au fait que le mandrin soit hors axe par rapport à l’étage en rotation et l’exécution de corrections de champ plat pour assurer des intensités de pixels d’arrière-plan uniformes sur la caméra fournissent des conditions d’imagerie optimales pour la meilleure résolution et des ensembles de données comparables sur plusieurs scans. Ouvrez la porte du scanner pour accéder au mandrin de scène rotatif en cliquant sur l’icône ‘ Ouvrir laporte’ dans le coin supérieur gauche du logiciel. Fixez l’échantillon en resserrant le collier autour de la base du porte-échantillon.REMARQUE: Utilisez une légère pression lors de la fixation de l’échantillon au mandrin rotatif pour maintenir l’alignement du scanner. Définissez les paramètres de numérisation dans le logiciel contrôlant le scanner pour une résolution et un contraste optimaux.REMARQUE: Ceux-ci devront être déterminés empiriquement car la source de rayons X, la caméra / détecteur et la géométrie de chaque scanner varieront selon le fabricant. Des informations supplémentaires pour sélectionner les meilleurs paramètres peuvent également être trouvées ici43, ainsi que du spécialiste de l’application du fabricant. Ouvrez le contrôle d’alimentation de la source X-Ray (Options | Source de rayons X). Utilisez les barres coulissantes pour régler la tension des rayons X à 30-40 kV et le courant à 100-110 μA pour produire un faisceau de rayons X avec une puissance de 3-4W et une petite taille de point pour une résolution améliorée. Utilisez la boîte de dialogue Modes d’acquisition (Options | Modes d’acquisition) pour régler le temps d’exposition de l’appareil photo à 500-800 ms. Utilisez la barre de défilement située à côté de l’icône de la loupe en bas du logiciel pour définir la taille de pixel d’image souhaitée (~700 nm à 4 μm), en fonction des paramètres et de la position de l’appareil photo. Cela détermine le nombre d’images de projection acquises pendant la numérisation, avec plus de projections conduisant à une résolution améliorée mais des temps de numérisation plus longs (voir Résultats représentatifs). Cliquez et faites glisser la barre de défilement située à côté de la flèche rotative en bas du logiciel pour déplacer l’échantillon le long de son chemin de rotation à 360°. Assurez-vous que l’échantillon reste dans le champ de vision. Cliquez sur l’icône ‘Démarrer l’acquisition’ (icône en forme de flèche de cercle bleu) en haut du logiciel. Une boîte de dialogue s’affiche qui permet de définir des paramètres d’analyse supplémentaires et de nommer le fichier et le dossier de sortie dans lesquels l’analyse sera enregistrée. Réglez le mouvement aléatoire sur 10 et définissez en moyenne 4 à 6 images. L’étape de rotation est calculée automatiquement en fonction des paramètres de la caméra utilisés. Commencez l’analyse en cliquant sur ‘OK’ dans la boîte de dialogue Acquisition. Une deuxième boîte de dialogue de barre de progression s’affiche et indique l’heure de l’analyse. Le scanner va maintenant acquérir une série d’images de projection(Figure 1D)de l’échantillon le long de la trajectoire de rotation et n’a pas besoin d’être surveillé. 6. Reconstruction Pour générer les tomogrammes, effectuez une reconstruction d’image à l’aide des images de projection.REMARQUE: Alors que presque toutes les reconstructions d’images à partir de scanners de géométrie de faisceau conique reposent sur l’algorithme de Feldkamp16,les paramètres individuels varient en fonction de l’implémentation du logiciel et doivent être déterminés empiriquement. Les paramètres suivants, spécifiques à un logiciel disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux),peuvent être utilisés comme guide. Des paramètres tels que la compensation du désalignement, la réduction des artefacts de l’anneau et la correction du durcissement du faisceau (0 % pour la plupart des échantillons de mouches) sont effectués de manière itérative afin de choisir les meilleures valeurs pour la reconstruction finale. Pour les utilisateurs avancés qui souhaitent plus de contrôle sur le processus de reconstruction, consultez l’interface MATLAB ici44. Effectuez un alignement initial de l’image à l’aide d’un algorithme de correction de décalage basé sur les analyses de référence45 (Actions | Alignement X/Y avec un balayage de référence). Affiner chaque paramètre de reconstruction (Démarrer | Réglage fin). Cela active une boîte de dialogue ‘Réglage fin des paramètres’. Affinez l’alignement en cliquant sur ‘Suivant’ à ‘Post-Alignement’. Définissez le nombre d’itérations sur cinq et l’étape de paramètre sur 1.0. Cliquez sur le bouton Démarrer pour générer une série d’aperçus. Sélectionnez l’image correctement alignée.REMARQUE : Une image correctement alignée ne sera pas floue ou n’affichera pas d’artefacts de « cisaillement » lorsqu’une structure autrement continue (telle que la cuticule) apparaît divisée. Affinez la réduction des artefacts de l’anneau en cliquant à côté de celui-ci. Définissez le nombre d’itérations sur cinq et l’étape de paramètre sur 1.0. Cliquez sur le bouton Démarrer pour générer une série d’aperçus. Sélectionnez l’image qui contient le moins d’anneaux. Une fois que les paramètres ci-dessus ont été optimisés pour donner la meilleure image, assurez-vous que les valeurs sélectionnées sont correctement représentées dans l’onglet Paramètres (Paramètres). Ajustez toutes les valeurs finales de luminosité et de contraste à l’aide de l’histogramme, des paramètres de fichier tels que la profondeur et le type de bits, et utilisez une région d’intérêt (ROI) englobant uniquement les structures d’intérêt (par exemple, la mouche entière ou la tête uniquement) pour réduire le temps de calcul(sortie). Commencer la reconstruction (Démarrer | Début). Si plusieurs reconstructions sont nécessaires, ajoutez l’image actuelle au gestionnaire de lots (Démarrer | Ajouter au lot) et répétez les étapes 6.2 à 6.5 pour les images restantes. 7. Analyse d’images Visualisez les tomogrammes en deux et trois dimensions et effectuez d’autres analyses morphométriques avec des logiciels gratuits ou commerciaux.REMARQUE: Les détails du logiciel utilisé dans ce protocole sont disponibles dans le tableau des matériaux. D’autres progiciels capables d’évaluer les ensembles de données μ-CT incluent des options de logiciels gratuits telles que FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47et ITK-SNAP48, ainsi que des logiciels commerciaux (par exemple, AMIRA). D’autres applications qui utilisent des algorithmes basés sur l’apprentissage automatique pour semi-automatiser le processus de segmentation peuvent aider à accélérer les flux de travail et à réduire les biais humains (par exemple, Biomedisa49). Importez le fichier de tomogramme dans le logiciel (File | Importer des fichiers image). Les métadonnées associées au fichier doivent se charger automatiquement dans la fenêtre, mais peuvent également être définies manuellement pour correspondre aux propriétés de l’image. Pour segmenter une structure d’intérêt, cliquez sur l’onglet Segment sur le côté gauche de l’écran. Créer une nouvelle région d’intérêt (ROI) (Basic | Nouveau),donnez-lui un nom et sélectionnez une couleur appropriée. Définir la plage de seuils qui englobe la structure d’intérêt (Plage | Définir la plage) à l’aide de la barre de défilement. Sélectionnez un mode d’outil de peintre ROI 2D ou 3D approprié (ROI Painter | Option Pinceau). Pour peindre une zone définie par le seuil ; maintenez la touche Ctrl enfoncée tout en maintenant la touche gauche de la souris enfoncée. Pour supprimer une zone, maintenez la touche Maj enfoncée tout en maintenant la touche gauche de la souris enfoncée.REMARQUE: Pour modifier la taille du pinceau circulaire ou carré, faites simplement défiler la molette de la souris tout en maintenant les touches Ctrl ou Maj enfoncées. Continuez à peindre la structure d’intérêt tout au long de son volume Z. Convertir le retour sur investissement en maillage (Exporter | Vers un | mesh Normal). Mettez en surbrillance la superposition de maillage en cliquant dessus dans le panneau Propriétés et paramètres des données dans le coin supérieur droit. Lissez le maillage à l’aide d’un nombre approprié d’itérations (Smooth Mesh | Itérations).REMARQUE : Utilisez la même valeur d’itération de lissage de maillage pour toutes les images à comparer. Assurez-vous que les mesures du ROI du maillage(surface, volume et diamètre du féret)sont affichées dans le panneau Informations sur le côté droit de l’écran pour l’analyse morphométrique de base. Une analyse supplémentaire peut être effectuée à l’aide du module d’analyse d’objet. Effectuez le rendu de l’objet maillé et de l’image du tomogramme entier et visualisez-le en 3D. Utilisez Movie Maker intégré pour générer une vidéo de l’objet ( Clicdroit de la souris | Afficher Movie Maker) à l’aide d’images individuelles du visualiseur (Ajouter une clé).REMARQUE: Plusieurs améliorations visuelles peuvent également être appliquées au film à l’aide de l’onglet Effets visuels du panneau de droite pour mettre en évidence certaines fonctionnalités, etc. Exportez la vidéo à visionner à l’aide du bouton Exporter l’animation dans Movie Maker.

Representative Results

La figure 2 montre des images d’un embryon, de larves du3e stade, de nymphes au stade adulte pharate (P7) et d’une mouche femelle adulte colorée à l’iode et imagée hydratée dans l’eau à l’aide d’un scanner de paillasse commercial. Une excellente conservation et même une coloration des tissus délicats sont apparentes, ce qui permet d’identifier facilement tous les principaux organes et de les utiliser pour l’analyse morphométrique et la visualisation 3D. En règle générale, les numérisations qui acquièrent moins d’images de projection de l’échantillon offrent une résolution inférieure à celle des numérisations qui acquièrent plus d’images de projection, le compromis étant le temps passé à numériser. Bien que les temps de numérisation varient selon l’instrument et d’autres paramètres de numérisation, les numérisations qui acquièrent quelques centaines de projections (~ 3 μm de taille de pixel d’image) prennent environ 30 minutes par spécimen, tandis que les numérisations composées de milliers d’images de projection (taille de pixel d’image de 700 nm à 1,25 μm) peuvent prendre de 8 à 16 h. Une comparaison du même casque de mouche adulte pris en mode de balayage « lent » (milliers de projections) et « rapide » (des centaines de projections) est illustrée à la figure 3. Il est important de noter que les analyses morphométriques ne diffèrent pas entre les balayages « lents » et « rapides »(Figure 3C)40. Notre pipeline d’imagerie utilise donc des scans rapides pour générer une taille d’échantillon suffisamment grande pour l’analyse morphométrique, et des scans lents pour visualiser les défauts morphologiques ou anatomiques à une résolution plus élevée. En utilisant le logiciel (Étape 7), tout tissu ou système d’organe d’intérêt peut être segmenté et utilisé pour l’analyse morphométrique et visualisé en 3D à l’aide du cinéaste (Film 1). La figure 4 montre un exemple de l’abdomen de la mouche coloré avec de la PTA et imagé hydraté (eau) ou après un séchage par point critique (DPC) sur un microscope à rayons X (Table des matériaux). Les détails offerts par une combinaison de la PTA et les capacités de cette plate-forme sont facilement évidents dans ces images, de sorte que les cellules épithéliums individuelles de l’intestin moyen et les faisceaux de spermatozoïdes dans les testicules sont facilement résolus. Alors que l’image CPD montre une résolution légèrement accrue par rapport à l’échantillon hydraté, une meilleure préservation de l’ultrastructure des tissus délicats (tels que les cellules graisseuses près de la cuticule) est obtenue avec des échantillons hydratés (Film 2). Figure 1 : Vue d’ensemble de la conception du scanner et du montage des échantillons pour μ-CT. (A) Un μ-CT de paillasse commercial. (B) Vue à l’intérieur du scanner. La source de rayons X (à droite) émet des rayons X qui traversent l’échantillon situé sur une scène en rotation (flèche jaune). L’atténuation de ces rayons X génère un contraste d’image lorsqu’ils traversent l’échantillon et se composent d’un écran de scintillation qui convertit les rayons X en photons et d’une caméra CCD standard (à gauche). (C) Montage d’une mouche des fruits adulte pour une imagerie hydratée dans l’eau. Les points de connexion entre la pointe de la pipette et le support en laiton sont enveloppés dans un film de paraffine pour éviter les fuites et les dommages potentiels au scanner. Le mandrin de scène est également mis en évidence. Notez que l’embout de la pipette a été positionné légèrement hors axe, ce qui a entraîné un temps de balayage plus long et une résolution réduite lors de la reconstruction finale. (D) Une seule image de projection 2D d’une mouche femelle adulte; des centaines à des milliers de ces projections sont acquises lors d’un scan le long de l’axe de rotation et sont utilisées pour la reconstruction afin de générer des tomogrammes contenant une résolution isotrope et des informations 3D précises. Barres d’échelle (C) = 2 mm. P, postérieur; V, Ventral. Ce chiffre a été modifié à partir de Schoborg et al.40. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Tous les stades du cycle de vie de Drosophila melanogaster, imagés par μ-CT. Échantillons colorés à l’iode et imagés hydratés dans l’eau. Une seule tranche 2D est montrée. (A) Un embryon qui a terminé les premiers stades de la gastrulation (astérisque). (B) Une larve du troisième stade. (C) Un adulte pharate P7 pendant la métamorphose. (D) Une femelle adulte. Divers organes sont mis en évidence: BWM, muscles de la paroi corporelle; Br, cerveau; Cd, cardia; Cr, culture; DLMs, muscles longitudinaux dorsaux; DVM, muscles ventraux dorsaux; E-AD, disque œil-antenne; Em, embryon; FB, corps gras; FPC, cellules du corps gras; H, cœur; Hg, intestin postérieur; La, lamina; L, jambe; Mg, intestin moyen; OL, lobe optique du cerveau; Ov, ovipositeur; PC, cuticule nymphaire; SG, glandes salivaires; VNC, cordon nerveux ventral; W, aile; WD, disque d’aile. Barres d’échelle (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, dorsale; A, antérieur; L, à gauche. Paramètres de balayage : Distance de la source à l’échantillon (mm) : (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Distance de la source à la caméra (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Taille des pixels de l’appareil photo (μm): (A-D) 11.6. Taille des pixels de l’image (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Les paramètres de numérisation et la résolution de l’image ne modifient pas les analyses morphométriques. Une tête adulte scannée à l’aide des paramètres de scanner« rapides » (descentaines de projections) et(B, B)« lents » (des milliers de projections) (des milliers de projections). Le cerveau est souligné en jaune. (C) Mesures du volume cérébral à partir de scans lents et rapides. Structures mises en évidence : AL; lobe d’antenne; CB, cerveau central; FB, corps en forme d’éventail; FCs, cellules graisseuses; La, lamina; Lo, lobula; LoP, plaque de lobula; Moi, médulla; Re, rétine. n = 5, le test t de Welch. ns = non significatif. Barres d’échelle = 100 μm. Paramètres de balayage : Distance de la source à l’échantillon (mm) : (A) 44,4, (B) 36,5. Distance de la source à la caméra (mm): (A) 348 (B) 350. Taille des pixels de l’appareil photo (μm): (A-B) 11.6. Taille du pixel de l’image (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Ce chiffre a été modifié à partir de Schoborg et al.40. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Abdomen de Drosophila melanogaster imagé par microscopie à rayons X. Les abdomens ont été colorés avec 0,5% de PTA et imagés hydratés (eau) ou après un séchage par point critique (DPC). (A) Point critique Abdomen séché, montré du point de vue YZ et (A’) XZ. (B) Abdomen hydraté, montré du point de vue YZ et (B’) du point de vue XZ. Divers organes sont mis en évidence: FC, cellules graisseuses; Hg, intestin postérieur; Mg, intestin moyen; SP, pompe à sperme; Te, Testes. Barres d’échelle (A) = 250 μm. D, dorsale; A, antérieur; L, à gauche. Paramètres de balayage : Distance de la source à l’échantillon (mm) : (A) 6,7, (B) 7. Distance de la source à la caméra (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objectif: (A-B) 4X. Taille du pixel de l’image (μm): (A-B) 0,65. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Film 1: Une troisième larve d’étoile, rendue en 3D à l’aide du Movie Maker dans Dragonfly. Les organes mis en évidence comprennent le cerveau (jaune), les disques imaginaux œil-antenne (rouge), le corps gras (bleu) et les muscles de la paroi corporelle (vert). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film. Film 2 : Comparaison d’échantillons imagés dans l’eau ou suite à un séchage par point critique. Les abdomens colorés avec 0,5% de PTA sont montrés. Les deux abdomens ont été scannés avec des paramètres de taille de pixel d’image identiques (0,65 μm). Une série de tranches 2D sont présentées dans un format « Z-stack » (YZ) commençant à la surface dorsale et se terminant à la surface ventrale de l’abdomen. Organes mis en évidence: FC, cellules graisseuses; Mg, intestin moyen; SP, pompe à sperme; Te, Testes. Paramètres de balayage : Distance de la source à l’échantillon (mm) : (A) 6,7, (B) 7. Distance de la source à la caméra (mm): (A) 28 (B) 29,5. Objectif: (A-B) 4X. Taille du pixel de l’image (μm): (A-B) 0,65. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Discussion

Visualiser le Mélanogastre intact de Drosophila à tous les stades de développement est resté un défi, principalement en raison de l’incompatibilité de la microscopie optique avec la cuticule épaisse et pigmentée trouvée chez cet animal. Alors que d’autres méthodes d’imagerie d’animaux entiers, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomographie par cohérence optique (OCT) et l’ultramicroscopie couplée à la clairière des tissus ont été utilisées avec succès chez les mouches50,51,52,53 , 54, μ-CT présente un certain nombre d’avantages qui le rendent idéal pour l’imagerie animale entière de cet organisme13,15,30 . Les rayons X pénètrent facilement dans la cuticule pigmentée et leur petite longueur d’onde permet une imagerie submicronique. L’étiquetage nécessite un investissement minimal dans des produits chimiques largement disponibles et aucune compétence spécialisée en laboratoire13. μ-CT sont également disponibles dans le commerce et les coûts sont comparables à ceux des plates-formes de microscopie optique, tout en étant plus attrayants pour un plus large éventail de disciplines (géologie, paléontologie, ingénierie, etc.) qui peuvent également bénéficier de sa disponibilité dans une institution. Les sources de rayons X synchrotron peuvent également être utilisées pour l’imagerie μ-CT haute résolution d’insectes fixes et vivants31,55,56, mais sont moins accessibles que les scanners de paillasse commerciaux.

Ce protocole fournit un moyen efficace d’obtenir des images μ-CT d’adultes mouches, de nymphes, de larves et d’embryons cellularisés. Notez que pour la plupart des étapes décrites ci-dessus, d’autres méthodes peuvent également être appliquées pour préparer des échantillons pour l’imagerie. D’autres études ont fourni une comparaison détaillée des différentes étapes de fixation, d’étiquetage et de séchage pour une utilisation chez les insectes et ceux qui sont intéressés à adopter cette technique sont encouragés à évaluer les mérites de chaque approche1,4,13,29,30,57. Bien que ce protocole soit relativement simple, quelques suggestions utiles sont présentées.

Tout d’abord, des précautions doivent être prises lors de la perturbation de la cuticule d’échantillons intacts afin que les tissus mous sous-jacents ne soient pas perturbés de manière significative. Il est important de laisser les stades larvaires et nymphosés précoces subir une fixation pendant 2 heures dans la solution de Bouin avant de piquer. Cela rigidifiera le tissu et limitera la quantité d’hémolymphe qui suintera des trous de cuticule, ce qui peut modifier l’architecture des organes. Les segments individuels du corps (tête, thorax et abdomen) de l’adulte peuvent être séparés si la ou les structures d’intérêt y sont situées. Il est recommandé d’utiliser un scalpel pour trancher proprement ces segments plutôt que de les séparer avec des pinces, ce qui pourrait perturber l’architecture 3D de l’intestin ou du système nerveux central, par exemple. En ce qui concerne le timing, les adultes n’ont généralement besoin que de 16 heures. pour une fixation complète, alors que les stades larvaire et nymphal nécessitent 24 h. De plus, si la coloration à l’iode ou au PTA semble inégale, l’échantillon peut être remis en solution pour incuber plus longtemps jusqu’à ce que même la coloration soit obtenue. Enfin, les échantillons hydratés ne doivent pas être placés à 4 °C, car cela semble induire la formation de bulles d’air dans la cavité corporelle après le réchauffement à la température ambiante.

Deuxièmement, le montage de l’échantillon varie selon l’instrument, le type d’étage et si l’échantillon doit rester hydraté ou s’il a été séché au point critique. S’il est hydraté, assurez-vous que l’échantillon ne fuit pas et éventuellement détruisez le scanner. Lorsque vous montez l’échantillon à l’intérieur d’une pointe de pipette, assurez-vous de pousser doucement avec un objet émoussé jusqu’à ce que les échantillons rencontrent une légère résistance et ne puissent pas bouger. Pousser trop fort peut entraîner une déformation de la cuticule et des défauts structurels sous-jacents. Assurez-vous également que l’échantillon est aligné dans le support aussi près que possible de l’axe de rotation. Tout vacillement augmentera les temps de balayage en raison du champ de vision plus large et réduira la résolution du tomogramme final après la reconstruction.

Troisièmement, les paramètres du scanner pour l’acquisition d’images de projection varient également d’un instrument à l’autre. Pour maximiser les capacités de résolution du scanner, la taille du point de faisceau de rayons X doit être aussi petite que possible (5-10 μm). Cela peut être réalisé en équilibrant les paramètres de tension et de courant des rayons X de sorte que la puissance totale soit de 3 à 4 W. Avec ces réglages et le temps d’exposition approprié sur l’appareil photo, une atténuation appropriée du faisceau de rayons X par l’échantillon et un contraste d’image optimal peuvent être obtenus. L’utilisation de filtres en aluminium ou en cuivre entre l’objet et la source de rayons X peut être utilisée pour affiner les paramètres optimaux d’énergie des rayons X pour obtenir le meilleur contraste d’image ou atténuer suffisamment le faisceau pour que des sources plus puissantes puissent être utilisées. En ce qui concerne la résolution de l’image, cela dépendra de nombreuses variables différentes, y compris le type de tache, le nombre d’images de projection, la taille des pixels de l’image, la position de la caméra, le mouvement de l’échantillon, les vibrations du scanner et les paramètres de reconstruction. Un fantôme de motif de barre (QRM GmbH) contenant des marqueurs de taille connus peut aider à évaluer la résolution spatiale pour un scanner et un réglage de caméra donnés.

Il convient également d’évaluer les mérites de l’imagerie d’échantillons séchés ou hydratés à des points critiques. Sombke et al. ont effectué une évaluation comparative des deux méthodes et ont constaté que le séchage des points critiques était supérieur pour les applications de μ-CT impliquant des arthropodes30. Cependant, les avantages des échantillons hydratés sont que les animaux sont soumis à moins d’exposition chimique et mécanique, ce qui pourrait entraîner des artefacts quantitatifs et morphologiques. Cela tend également à mieux préserver les tissus délicats que le DPC. Cependant, les échantillons hydratés ont une durée de conservation beaucoup plus courte et doivent être imagés au plus tard un mois après la fixation, car la dégradation des tissus et la qualité réduite de l’image deviennent évidentes à ce stade. De plus, la résolution des échantillons hydratés sera légèrement inférieure à celle d’un échantillon séché à un point critique, car les rayons X doivent également pénétrer à travers une pointe de pipette en plastique et le liquide environnant (eau ou tampon). Les échantillons séchés aux points critiques peuvent être conservés pendant des périodes beaucoup plus longues, en particulier lorsqu’ils sont conservés sur Drierite. Ils peuvent également être placés directement dans le chemin du faisceau de rayons X en collant simplement les ailes ou les pattes à une épingle à insectes et en les plaçant dans le mandrin de la scène, simplifiant ainsi le processus de montage. Cependant, la déshydratation étendue à l’éthanol de ces échantillons peut entraîner un rétrécissement des tissus et une perte de l’architecture délicate des tissus, c’est pourquoi il est important d’effectuer une gamme de concentrations croissantes d’EtOH pour minimiser ces effets. Néanmoins, il convient de noter que toutes les formes de traitement chimique, y compris la fixation du paraformaldéhyde et même la coloration à l’iode peuvent provoquer un rétrécissement destissus58,59. Bien qu’aucune des deux méthodes ne fournisse de mesures de la « taille réelle des organes » chez une mouche vivante, les mesures morphométriques sont toujours valables lors de la comparaison d’animaux mutants et sauvages, à condition que les étapes de fixation, de coloration et de séchage soient effectuées de manière identique pour les deux ensembles d’échantillons, de préférence en parallèle.

En conclusion, μ-CT fournit un outil d’imagerie animal entier utile pour drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. De nombreuses autres études ont montré la puissance de cette technologie pour comprendre divers aspects de la taxonomie des insectes, de l’écologie, de la physiologie, du développement et de l’anatomie qui peuvent aider à éclairer les futures études sur les mouches1,28,30,31,32,55,56,57 . Combiné aux outils génétiques et de microscopie optique déjà largement utilisés dans cet organisme, μ-CT peut se positionner dans un pipeline expérimental qui permet une compréhension plus approfondie entre le génotype et le phénotype.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Rien de tout cela n’aurait été possible sans le soutien de Nasser Rusan. J’aimerais remercier H. Doug Morris, Danielle Donahue et Brenda Klaunberg du NIH Mouse Imaging Facility et Ben Ache de Micro Photonics pour leur formation et leurs discussions utiles. Je remercie également Mansoureh Norouzi Rad de Zeiss d’avoir scanné des échantillons d’abdomen sur la Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith et Rachel Ng ont également aidé à la numérisation. Mike Marsh d’Object Research Systems a fourni le soutien technique de Dragonfly. Je suis également reconnaissant du soutien du National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) et des fonds de démarrage de l’Université du Wyoming. Je remercie également les réviseurs anonymes pour leurs suggestions et commentaires utiles.

Materials

100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)
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Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).
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