定量自发 Ca²⁺ 通量及其在原发性小鼠中脑神经元中的下游效应

所有涉及动物主体使用的程序都已获得德克萨斯A&M大学机构动物护理和使用委员会的批准（2019年 11月25日;AUP# 2019-0346）。 注：应使用生物安全柜中的无菌程序制备细胞培养溶液，并在0.2 μm时过滤，以防止污染。 1. 制定解决方案和文化媒介 通过将 20 μL 的 1 mg/mL 层压素库存稀释到 2 mL 的无菌蒸馏 H2O 中，准备层压层压涂层溶液。 通过将 5 mL 的 ES 添加到 45 mL 的 1x 汉克平衡盐溶液 （HBSS）， 准备 10% 的马 （马） 血清 （ES） 停止溶液。使用 0.2 μm 过滤器系统或注射器滤片尖端进行无菌过滤器。储存在4°C。 通过将 2 克 BSA 粉加入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并达到 45 mL 的最终体积，准备 4% 牛血清白蛋白 （BSA） 库存溶液。使用 0.2 μm 过滤器系统或注射器滤片尖端进行无菌过滤器。储存在4°C。 在 1x HBSS 中将木瓜素稀释至 3 mg/mL，以准备木瓜库存溶液。使用 0.2 μm 过滤器系统或注射器滤片尖端进行无菌过滤器。储存在-20°C。 准备脱氧核酸酶（DNase）溶液，将20毫克DNase粉加入无菌H2O，使最终体积达到20 mL。使用 0.2 μm 过滤器系统或注射器滤片尖端进行无菌过滤器。储存在-20°C。 通过将352毫克抗坏血酸加入无菌蒸馏H 2 O，使最终体积达到20mL，准备抗坏血酸库存溶液。在37°C浴中加热，如有必要溶解。使用 0.2 μm 过滤器系统或注射器滤片尖端进行无菌过滤器。储存在-20°C。 通过将以下神经基础培养基添加到 50 mL 中来制备细胞培养基：500 μL 的谷氨酸（100 倍）、500 μL 的马血清、 1 mL 的 B-27、100 μL 的抗坏血酸、500 μL 的青霉素-链霉素、50 μL 的卡那霉素和 50 μL 的氨基霉素。使用 0.2 μm 滤波器系统进行无菌过滤器。储存在4°C。 通过将 1 mL 的 Triton X-100 添加到 9 mL 的 1x PBS 中，准备 0.01% Triton X-100 解决方案，从而获得 10% 的解决方案。由于Triton X-100是粘性的，移液器缓慢，让尖端完全填充。在37°C浴中加热，如有必要溶解。储存在4°C。 要将 10% Triton X-100 库存稀释至 0.01%，请执行 3 次连续 1：10 稀释。将 1 mL 的 10% 库存稀释成 9 mL 的 1x PBS，使 1% 溶液。将 1 mL 的 1% 溶液稀释成 9 mL 的 1x PBS，使溶液达到 0.1%。将 1 mL 的 0.1% 溶液稀释成 9 mL 的 1x PBS，使溶液达到 0.01%。 通过将 1 mL 的 NGS 添加到 9 mL 的 1x PBS 中，为 10% 溶液添加 1mL，准备 10% 和 1% 的正常山羊血清 （NGS） 溶液。将 100 μL 的 NGS 添加到 9.9 mL 的 1x PBS 中，可制备 1% 溶液。 准备谷氨酸库存溶液（100 mM），将735毫克L（+）-谷氨酸加入无菌蒸馏H2O，并达到50 mL的最终体积。这种浓度的溶解性将是一个问题。加入小体积（100 μL）1 M盐酸足以提高溶解度。 准备NBQX库存溶液（10 mM），将50毫克NBQX加入无菌蒸馏H2O，最终达到13 mL。 2. 准备文化菜肴和盖玻片（解剖前一天完成） 注：我们发现，结合三种涂层剂，聚L-莱辛，聚L-奥尼辛和层氨基，允许理想的细胞粘附性和生存能力。 将 10 个 35 mm 培养皿放在生物安全柜中。在每个盘中放置两个圆形 12 mm 盖玻片，并填充 70% EtOH 10 分钟。使用真空管路从每道菜中吸出剩余的 EtOH，使 EtOH 完全蒸发。 将 0.1% 聚 L-晶硅氨酸溶液移液 90-100 μL 的每个盖玻片上，确保整个盖玻片由聚-L-lysine 溶液覆盖。用盖子盖住盘子，放在37°C的培养箱中1小时。 从每个盖玻片中吸出剩余的聚L-lysine溶液，并用无菌H2 O冲洗。 使用 0.1% 聚 L-二苯胺溶液重复步骤 2.2 = 2.3。 同样，使用 0.01% 层压溶液重复步骤 2.2 = 2.3。放在37°C/5%CO2 培养箱中，直到第二天准备好进行细胞电镀。 3. 小鼠胚胎解剖 注：我们每个培养使用4至6个时间期怀孕小鼠。虽然大部分解剖过程发生在生物安全柜之外，但维持无菌过程仍然很重要。在解剖显微镜附近的表面和手术工具上大量使用 70% EtOH 是理想的选择。在解剖过程中也可能戴口罩，以进一步防止污染。此外，我们在培养培养媒介中使用4种单独的抗生素，因此不太可能受到污染。然而，如果使用抗生素有问题，这种解剖装置可以移动到无菌罩内。为了保持细胞生存能力，所有解剖溶液应在4°C时预冷却，解剖应尽快完成。我们不在冰上进行解剖。小鼠胚胎中脑神经元解剖方法与先前描述的方法,9、10相同。9 在解剖显微镜附近的长凳上用吸水垫准备一个空间，并自由喷洒 70% EtOH。 喷两个 100 x 15 mm 玻璃培养皿和一个 50 x 10 mm 玻璃培养皿与 70% EtOH，并允许 EtOH 蒸发。蒸发后，将50 mL的无菌1x HBSS放入每100 x 15毫米培养皿中。 将手术剪刀、钳子和微切刀片在 70% EtOH 中下潜，至少消毒 10 分钟。将仪器放在吸水垫上晾干。 使用CO2， 然后是宫颈脱位，在胚胎第14天安乐死2-3个月大的时间妊娠小鼠。 用70%的EOH喷洒安乐死小鼠的腹部。用钳子抓住下腹部，用手术剪刀打开腹腔。开始切割附近的钳子举行腹部，使两侧的横向切割，直到腹部壁可以折叠回来，子宫清晰可见。 使用手术剪刀，切开子宫角的两端。然后取出子宫，放入培养皿中，用1xHSS。 使用直尖钳小心地从子宫中取出胚胎。在整个过程中将胚胎留在HBSS中。使用钳子或显微切刀，通过靠近颈部切割快速斩首胚胎。使尽可能平的切割。 在解剖显微镜下，将胚胎头移动到干燥的 50 mm 培养皿上，并放在腹侧。通过放置和穿透眼睛/鼻子附近，用钳子稳定头部。钳子应向下倾斜在 [45]， 以避免穿透梅森脑。 使用另一只手的钳子，小心地去除半透明的皮肤和头骨层，就在脑积的突出脊之前。开始靠近中线，并去除皮肤和头骨，直到脑积水完全暴露。 握住垂直于暴露的脑膜的钳子，皮层和脑膜之间的一个尖端，另一个尖在小脑附近。向下按压并捏合钳子以拆下整个中脑。中脑段应大约 0.5 mm 厚。将中脑部分放入第二个装满新鲜 1x HBSS 的培养皿中。对每个胚胎重复此过程。 使用解剖显微镜，将大脑部分与心室朝上定位。如果脑筋仍然连接，小心地将其取出，用钳子抓住，提起和离开大脑部分。 大脑部分应有4个可见的象限。将段放置的方式是两个较小的象限位于优于两个较大的象限的位置。有一个突出的山脊，将上一个（小）象限与下级两个（大）象限隔开。 使用钳夹紧，将上限与下限分开，然后丢弃上级象限。剩余的劣质象限在后侧横向有多余的组织，这种组织看起来比剩余的腹体组织更不透明。取出较不密集的后体组织并丢弃。其余部分应同时包含 Substantia nigra pars Compacta （SNc） 和腹体区 （VTA）。 使用钳子将剩余的腹体组织部分切成 4 个较小的部分，并使用 1mL 宽的孔移液器在 15 mL 锥形管中传输这些段，带 1x HBSS。在整个过程中，将带大脑部分的圆锥管放在冰上。 对所有剩余大脑部分重复此过程。 4. 细胞分离 细胞酶消化 小心地从含有中脑段的 15 mL 锥形管中吸气 HBSS，将管底的段留在管子底部。 将 ±800 μL 的木瓜溶液加入管子，放在 37°C 培养箱中 7 分钟。通过轻拂管子将细胞重新暂停，并更换到 37°C 培养箱中，再增加 7 分钟。 使用宽孔 1 mL 移液器尖端，仅将中脑段移除为 1 mL 的 DNase 等分。允许段到达等分的底部或约 1 分钟的曝光。 使用宽孔 1 mL 移液器尖端，仅将中脑段拆下到包含 2 mL 止解的 15 mL 锥形管中。让段在管底沉淀，并在充满止损溶液的附加锥形管中重复冲洗。 细胞悬浮液的机械三化 在第二停止溶液冲洗管中，使用宽孔1 mL移液器尖端，移液器细胞上下10次，直到没有可见的大组织段。对于最小的细胞解解，避免过度三化是重要的。 缓慢移液器 300 μL 的 4% BSA 溶液到含有脑段的 15 mL 锥形管的底部。小心地拆下移液器尖端，以保持悬架层。在0.4 x g下 离心3分钟。然后在400μL细胞培养培养培养中小心吸进上一提和再增殖细胞。 5. 电镀细胞 注：根据经验，每个胚胎收集大约100，000个活细胞。2-3个月大的定时怀孕小鼠通常有8-10个胚胎的垃圾大小;因此，对每只正点怀孕小鼠细胞总产量的粗略估计约为100万个细胞。 使用血细胞计预形成细胞计数，然后使用细胞培养基将悬浮液稀释至2，000个细胞/μL。短暂三重奏混合。 从步骤 2 中取出带层压素溶液的盖玻片，并使用真空吸气从涂层盖玻片中吸走剩余的层压剂溶液。板快速，以避免盖玻片完全干燥。将 100 μL （2.0 x 105 细胞/盖玻片） 移液到每个盖玻片上，将培养皿放入 37°C 培养箱中 1 小时。 小心地将3 mL的细胞培养基添加到每道菜中，并放回37°C培养箱中。预制半介质每周更改 2 次，为期 2 周。 6. 14 DIV细胞培养感染腺相关病毒（AAV）载体 对于每道菜准备 1 mL 的血清免费 DMEM 介质与 1 μL 的 hSyn-GCaMP6f AAV （1.0 x 1013 滴度） 从每道菜中吸出细胞培养基，代之以含有 hSyn-GCaMP6f 的 1 mL 无血清 DMEM。将盘子放回 37 °C 培养箱中 1 小时。 吸气含有AAV的血清自由培养，代之以3mL的细胞培养培养。将菜肴放回 37 °C 培养箱中。我们发现，5-7天的AAV感染允许理想的GCAMP表达水平。在整个病毒感染期间，每2-3天继续更换一次介质。 7.19-21 DIV 之间的实时共声 Ca 2+ 成像 注：如步骤6.3所述，成像可以在病毒感染后5-7天内完成。这是实现荧光团在允许检测自发 Ca 2+ 活性的水平上可见表达的理想窗口 。 准备记录缓冲区 要制作 1 L 的 HEPES 记录缓冲区，请添加：9.009 g 的 NaCl， 0.3728 g KCl，0.901 g D-葡萄糖，2.381 g HEPES，2 mL 1 M CaCl2 库存溶液，500 μL 1 M MgCl2 库存溶液到 800 mL 无菌蒸馏 H2O.，使用 NaOH 将 pH 引入 7.4。将最终音量达到 1 L。 要使200 mL的20μM谷氨酸记录缓冲液，稀释40μL的100 mM谷氨酸库存溶液到200 mL的 HEPES 记录缓冲液上述。 要使 200 mL 的 10 μM NBQX 记录缓冲液，将 200 μL 的 10 mM NBQX 库存溶液稀释为 200 mL 的 HEPES 记录缓冲液。 共体成像 用 3 mL 的录音缓冲液填充无菌 35 mm 培养皿。 从 37 °C 培养箱中取出具有受感染培养物的 35 mm 培养皿。使用精细的尖端钳子，小心地抓住一个盖玻片的边缘，并快速将其转移到装满记录缓冲液的培养皿中。将剩余的盖玻片以中等水平放回 37°C 培养箱中。用记录缓冲器将盘子运送到共和显微镜。 启动映像软件。在初始化时继续执行下一步。 启动近位泵，将管路放入记录缓冲器中。将流量速度校准为 2 mL/min。 将受感染的盖玻片从 35 mm Petri 盘转移到录音浴中。 使用 10 倍水浸目标及 BF 光，找到焦点平面，并寻找神经元细胞体高密度区域。切换到 40 倍水浸目标，并使用 BF 光重新聚焦样品。 在 FluoView 中的”染料列表”窗口中，选择 AlexaFluor 488 并应用它。 AAV表达式可以是可变的;因此，为了防止荧光团过度暴露和光漂白，请从低高压和激光功率设置开始。对于 AlexaFluor 488 通道，将高压 （HV） 设置为 500，增益设置为 1 倍，偏移设置为 0。对于 488 激光线，功率设置为 5%。为了增加 z 平面中成像的有效体积，将针孔尺寸增加至 300 μm。使用”对焦 x2″扫描选项以最佳方式将发射信号调整到低于饱和度水平。从这里，可以调整设置，直到实现每个通道的理想可见性。注：要使用 GCaMP 准确捕获 Ca2+ 通量 的全范围，请调整基准 HV 和激光功率设置，以便在不使探测器过度饱和的情况下增加荧光强度。 一旦显微镜设置得到优化，移动舞台，以便定位一个区域，多个细胞显示 GCaMP6f 荧光中的自发变化，并聚焦到所需的平面进行成像。 使用”Clip rect”工具将成像帧剪辑到可达到不到 1 秒的帧间隔的大小。这是将成像间隔设置为 1 帧/秒所必需的。 将”间隔”窗口设置为值 1.0，将”Num”窗口设置为 600。注：为了在所需的时间点（300 s）提供不同的记录缓冲器，必须校准泵的延迟，以便向浴缸提供新的解决方案。这取决于溶液灌注速率（2 mL/min）和泵溶液的管路长度。 要捕获 t 系列影片，请选择”时间”选项，然后使用”XYt”扫描选项开始成像。 观看成像进度条，并在适当的时间点将线从 HEPES 记录缓冲区移动到 20 μM 谷氨酸记录缓冲区（例如，如果泵的延迟被校准以在 60 s 时提供溶液，则将线路移动到谷氨酸缓冲器中，在 240 帧时，以便在 300 s 时提供谷氨酸）。 完成成像后，选择” 完成系列” 按钮并保存完成的 t 系列影片。继续使用20μM谷氨酸，额外5分钟，使培养的神经元已暴露在谷氨酸共10分钟。对要成像的每个盖玻片重复此过程。 在额外 5 分钟接触 20 μM 谷氨酸后，从浴池中取下盖玻片，放回包含记录缓冲液的 35mm Petri 盘中盘，直到成像完成。完成后，继续执行步骤 8。 Ca2+ 跟踪分析 在 ImageJ 中执行图像分析。安装 ImageJ 的 BIO-FORMAT 插件，允许。要打开的 OIB 图像文件。 在 ImageJ 工具栏中，单击” 分析 | “设置”测量”，并选择”平均灰色值”（MGV）的框。 在 ImageJ 中，打开一部 t 系列电影作为超堆栈。 拖动影片的滑块，用最大的谷氨酸响应识别帧，以可视化所有对谷氨酸有反应的神经元。使用多边形工具跟踪所有可见的神经元细胞实体，将它们的 ROI 添加到”ROI 管理器”列表中。 完成跟踪和添加 ROI 后，选择 ROI 管理器窗口中的所有 PI，并在更多选项列表中使用”多度量值”选项。复制这些数据并将其粘贴到电子表格中。完成此过程，用于分析所有影片。 对于每个 ROI，使用等式将每个帧的原始 MGV 数据转换为 +F/F0 值：\F/F0 = =F（t） = F0= / F0。其中 任何给定帧的 F（t） = MGV， 以及 F0 = 平均基线 MGV 为 ±10 帧，其中不存在 Ca2+ 通量。 使用诸如 OriginPro 2020 等统计软件，可将转换后的+F/F 0 跟踪转换为线图。可以使用”峰值分析仪”功能（如果使用其他软件，可以使用类似的功能）测量谷氨酸响应的峰值振幅、对谷氨酸的响应延迟以及曲线下的区域。 8. 文化的免疫 注：使用甲醛固定后，盖玻片可储存在 4 °C 的 1x PBS 中，直到准备好进行免疫处理。初级抗体和次生抗体的孵育以连续的方式进行，如与抗卡斯帕塞-3初级抗体进行孵育，其补充性二级抗体在与抗TH初级抗体及其互补的次级抗体的孵育之前进行。 紧接着谷氨酸暴露，将盖玻片放回其35毫米培养皿，吸气记录缓冲液，并添加3 mL的10%正式素。让我们在室温 （RT） 下坐 40 分钟。 用1x PBS冲洗盘子3次。 在PBS中吸入PBS和渗透细胞在1mL的0.01%Triton X-100中2分钟。 用1x PBS冲洗盘子3次。 在PBS中，将PBS和块细胞吸入1mL的10%NGS中40分钟。 用1x PBS冲洗盘子3次。 在PBS中加入1μL的兔抗卡斯帕塞-3原抗体至1mL的1%NGS（1：1000稀释）。从培养皿中吸出PBS，代之以原抗体溶液。放在摇床上，在RT处孵育1.5小时。 用1x PBS冲洗盘子3次。 在PBS中加入1μL的山羊抗兔Alexfluor 488二次抗体到1mL的1%NGS（1：1000稀释）。从培养皿中吸出PBS，代之以二次抗体溶液。放在摇床上，在RT处孵育1小时。 用1x PBS冲洗盘子3次。 重复步骤8.7~8.10，但在步骤8.7中使用鸡抗TH原抗体（1：1000）和步骤8.9中的山羊抗鸡亚历克萨弗594次抗体（1：1000）。 最后 PBS 冲洗后，将 30 μL 的安装介质放在显微镜幻灯片上。使用钳子从 35 mm Petri 盘上抓住盖玻片，将盖玻片与细胞朝下放置到安装介质中。如果放置正确，两个盖玻片将适合在单个显微镜幻灯片上。放在干燥、黑暗的区域，让安装介质在夜间干燥。 9. 免疫污染培养物的共振成像 共体成像 启动映像软件。将样品放在显微镜舞台上。 使用显微镜目镜，使用 20 倍放大镜和荧光光与 TRITC 过滤器，聚焦样品并搜索 TH+ 细胞体。 找到 TH+ 单元格主体后，在视场中居中，然后移动到 60 倍放大目标。 在”染料列表”窗口中选择 AlexaFluor 488 和 AlexaFluor 594 染料。 与实时成像一样，从低 HV、增益、偏移和激光功率设置开始，以防止光漂白。使用”焦点 x2″扫描选项来评估每个通道的荧光强度并相应地进行调整。由于这些图像稍后将量化为荧光强度，因此有必要在所有视点保持成像设置的一致性。因此，最好查看每个条件的几个示例，了解样本中的荧光强度范围。 确定理想的成像设置后，选择”对焦 x2″扫描选项，然后将感兴趣的单元格移动到视场的中心。使用”缩放”滑块将数字变焦缩放倍增加至 3 倍。 使用对焦旋钮，找到具有最亮荧光的对焦平面，并捕获单个平面 XY 图像。保存要完成的图像。 切换回 20 倍放大目标以搜索另一个 TH+ 单元格。重复此过程，直到从每个条件采样所需的单元格数。 图像分析 在 ImageJ 工具栏中，单击” 分析 | “设置”测量”，并选择”面积”、”集成密度”和”平均灰色”值的框。 通过拖放到 ImageJ 工具栏或通过文件菜单选择图像，将每个通道分隔成一个超级堆栈打开图像。 使用 TH 通道 （594 nm） 在细胞体周围绘制 PI。使用 ImageJ 中的多边形跟踪工具，密切跟踪单元格主体的外边缘。当细胞膜和细胞核之间的距离最小时，通过细胞胶追踪一条直线到细胞核的边缘，然后密切跟随细胞核的轮廓以排除细胞核。然后将一条直线追溯到外部膜，尽可能紧密地与初始线保持边界，并继续遵循细胞主体的轮廓，直到 ROI 完成。 使用键盘快捷键”T”或使用工具栏菜单路径 分析 |工具 |ROI 管理器，打开 ROI 管理器并将刚刚绘制到列表中的 ROI 添加。 选择 caspase-3 通道 （488 nm） 的窗口，然后在”ROI 管理器”列表中选择添加的 ROI。 在 ROI 管理器窗口中 ，选择”测量 ” 按钮。结果窗口将显示与之前设置的测量值一起。将它们复制到电子表格中，然后对每个单元格重复此过程。