概要

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Published: July 11, 2020
doi:

概要

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA’ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Abstract

MicroRNA’lar (miRNA’lar) hem bitkilerde hem de hayvanlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan endojen olarak ifade edilen kodlamayan, ~21 nt küçük RNA’lar sınıfıdır. MiRNA’ların çoğu, anahtar genleri hedefleyen gen ekspresyonunun negatif anahtarları olarak hareket eder. Bitkilerde, birincil miRNA ‘lar (pri-miRNA’lar) transkriptleri RNA polimeraz II tarafından oluşturulur ve pre-miRNA adı verilen kararlı kök-döngü yapılarının değişen uzunluklarını oluştururlar. Bir ensonükleaz, Dicer benzeri1, miRNA-miRNA* dublekslerine pre-miRNA’ları işler. MiRNA-miRNA* dubleks iplikçiklerinden biri seçilir ve hedef mRNA’ların bölünmesine aracılık etmek için Argonaute 1 proteinine veya homologlarına yüklenir. MiRNA’lar anahtar sinyal molekülleri olmasına rağmen, bunların tespiti genellikle hassas bir kuzey leke analizi yerine optimal PCR tabanlı yöntemlerden daha az yöntemle gerçekleştirilir. Biz çok yüksek hassasiyet ile miRNA düzeylerinin sayısallaştırılması için ideal basit, güvenilir ve son derece hassas kuzey yöntemi tarif, kelimenin tam anlamıyla herhangi bir bitki dokusundan. Ayrıca, bu yöntem boyutu, kararlılık ve miRNA ve öncüllerinin bolluğunu onaylamak için kullanılabilir.

Introduction

Küçük düzenleyici RNA’lar, mikroRNA’lar, son keşif onları ve bitki vehayvanlardakirollerini anlamak araştırma yol açmıştır 1 . MiRNA’ların uzun öncüleri HYL1 ve spesifik dicer benzeri proteinler2,3ile 21-24 nt olgun miRNA’lara işlenir. Bir 22 nt miRNA ikincil siRNA’lar4oluşturarak basamaklı susturma başlatabilirsiniz. Çalışmalar gelişme miRNA’lar ve ikincil siRNA’ların rolünü göstermiştir, hücre kaderi ve stres yanıtları5,6.

Kuzey hibridizasyonu belirli RNA moleküllerini tespit etmek için rutin olarak kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu yöntem, toplam RNA7bir havuzdan yaklaşık 19 -24 nt uzun küçük RNA tespitinde kullanımını özelleştirmektedir. Bu gösteride, miRNA’ların saptanması ve ölçülmesi için bu tekniğin kullanımını gösteriyoruz. Bu yöntem, radyoizotoplar kullanarak probların etiketlenmesi kullanır; böylece numunedeki miRNA düzeyleri artan hassasiyetle saptayabilir. PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin nicelemesini ve miRNA’ların boyut tayinini sağlar. Bu protokolde miRNA tespitini geliştiren önemli adımlar gösteriyoruz. MiRNA’ların yüksek çözünürlüklü sinyal algılaması için lekeleme ve hibridizasyon adımlarını değiştirdik. Bu teknik aynı zamanda siRNA, tasi-sekonder RNA ve snoRNA gibi diğer endojen küçük RNA’ların saptanması için de kullanılabilir.

Protocol

1. denaturing poliakrilamid jelin hazırlanması Tartmak ve üre 4.8 g ekleyin, % 40 akrilamid 3.75 mL ekleyin: bisacrylamide (19:1) çözeltisi ve 1 mL 10x TBE pH 8.2 steril 50 mL tüp içine. 60 °C’de bir su banyosu seti kullanarak üreyi berrak bir çözelti ye doğru çözün. Taze otoklavlı steril su kullanarak hacmi 10 mL’ye kadar makyajlayın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun. Taze (w/v) amonyum persülfat çözeltisi hazırlayın. </ol…

Representative Results

Bu gösteride indica rice var whiteponni’nin farklı dokularında miR397 ifadesini tespit ettik ve ölçtük (Şekil 1). miR397 22 nt miRNA ve korunmuş miRNA olduğunu. Test edilen tüm örneklerde miR397 ifadesi saptanabilir. Yeni nesil sıralama verilerine göre, örnek 1 (fide dokusu) milyonda 5 okuma (rpm) miR397’ye sahiptir. Sinyalini rahatça tespit ettik, bu yöntemin çok hassas olduğunu ve çok düşük miktardaki miRNA’ları bile tespit etmek için kullanılabil…

Discussion

Bu yöntem, daha az bol miRNA’lar da dahil olmak üzere küçük RNA’ların saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılabilir. Protokol esas olarak bir yükleme tamponunda toplam RNA’nın denatife, jel elektroforezinin boyut ayrımına, RNA’nın bir membrana aktarılmasına, RNA’nın membrana çapraz bağlanmasına ve istenilen radyoetiketli oligo probları kullanılarak hibridize edilmesine yönelik adımları açıklar.

Herhangi bir lekeleme deneyi için kritik adım, numune h…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar radyoizotop için ev sahibi enstitü ve BRIT tarafından sağlanan radyasyon laboratuvarına erişim kabul. PVS laboratuvarı Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi, Tata Temel Araştırma Enstitüsü ve hibeler tarafından desteklenir (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/İsviçre/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü’nden. MP DBT-Araştırma Associateship, DBT, Hindistan Hükümeti kabul eder.

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution Sigma A9926
Ammonium persulphate (APS) BioRad 1610700
Blotting paper whatmann blotting paper I 1001-125
Bromophenol blue Sigma B5525-5G
Capillary loading tips BioRad 2239915
Deionized formamide Ambion AM9342
Heating block Eppendorff 5350
Hybond N+nylon membrane GE RPN203B
Hybridization bottle Sigma Z374792-1EA
Hybridization Oven Thermo Scientific 1211V79
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T7024-25ml
PhosphorImager GE- Typhoon scanner 29187194
PhosphorImager screen and cassette GE healthcare GE28-9564-75
Pipettes Gilson, models: P20 and P10 FA10002M, FA10003M
Plastic pipette Falcon 357550
Polyacrylamide gel apparatus BioRad 1658003EDU
Sephadex G-25 column GE healthcare 27532501
Speed Vac Concentrator Thermo Scientific 20-548-130
Spinwin Tarsons 1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201S
Transblot apparatus BioRad 1703946
ULTRAHyb hybridization buffer Ambion AM8670
Urea Fischer Scientific 15985
UV-crosslinker UVP CL-1000L
Vortex Tarsons 3020
Water bath NEOLAB D-8810
Xylene cyanol Sigma X4126-10G

参考文献

  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
  4. Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
  5. Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
  6. Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
  7. Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
  8. Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
  9. Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

Play Video

記事を引用
Tirumalai, V., Prasad, M., Shivaprasad, P. V. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (161), e61394, doi:10.3791/61394 (2020).

View Video