Analyse des taches d’ARN pour la détection et la quantification des microARN végétaux
概要
Cette méthode démontre l’utilisation de la technique d’hybridation nordique pour détecter les miARN à partir de l’extrait total d’ARN.
Abstract
Les microARN (miARN) sont une classe de petites ARN non codantes, ~21 nt petites impliquées dans la régulation de l’expression génique chez les plantes et les animaux. La plupart des miARN agissent comme des commutateurs négatifs de l’expression génique ciblant les gènes clés. Dans les plantes, les transcriptions des miARN primaires (pri-miARN) sont générées par l’ARN polymérase II, et elles forment des longueurs variables de structures stables en boucle de tige appelées pré-miARN. Une endonuclease, dicer-like1, traite les pré-miARN en duplex miRNA-miRNA*. L’un des brins du duplex miRNA-miRNA* est sélectionné et chargé sur la protéine Argonaute 1 ou ses homologues pour monner le clivage des ARNm cibles. Bien que les miARN soient des molécules de signalisation clés, leur détection est souvent effectuée par des méthodes pcr moins qu’optimales au lieu d’une analyse sensible des taches nordiques. Nous décrivons une méthode nordique simple, fiable et extrêmement sensible qui est idéale pour la quantification des niveaux de miARN avec une sensibilité très élevée, littéralement à partir de n’importe quel tissu végétal. En outre, cette méthode peut être utilisée pour confirmer la taille, la stabilité et l’abondance des miARN et de leurs précurseurs.
Introduction
La découverte récente de petits ARN réglementaires, les microARN, a mené des recherches pour les comprendre et leur rôle dans les plantes et les animaux1. Les précurseurs longs des miARN sont transformés en miARN matures de 21 à 24 nt par HYL1 et des protéines spécifiques en forme de dicer2,3. Un 22 nt miRNA peut initier le silençage en cascade en générant des siRNA secondaires4. Des études ont montré le rôle des miARN et des siARN secondaires dans le développement, le destin cellulaire et les réponses au stress5,6.
L’hybridation nordique est une méthode expérimentale couramment utilisée pour détecter des molécules d’ARN spécifiques. Cette méthode personnalise son utilisation dans la détection d’environ 19 -24 nt longs petits ARN à partir d’un pool d’ARN totaux7. Dans cette démonstration, nous illustrons l’utilisation de cette technique pour la détection et la quantification des miARN. Cette méthode utilise l’étiquetage des sondes à l’aide de radioisotopes; ainsi, les niveaux de miARN dans l’échantillon peuvent être détectés avec une sensibilité accrue. Contrairement aux méthodes basées sur pcr, cette méthode assure la quantification de l’expression ainsi que la détermination de la taille des miARN. Dans ce protocole, nous montrons des étapes cruciales qui améliorent la détection de miRNA. Nous avons modifié les étapes de la blotting et de l’hybridation pour obtenir la détection de signaux à haute résolution des miARN. Cette technique peut également être utilisée pour la détection d’autres petits ARN endogènes tels que les siARN, les ARN tasi-secondaires et les arns snoARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode peut être largement utilisée pour la détection et la quantification de petits ARN, y compris les miARN moins abondants. Le protocole décrit principalement les étapes de dénaturation de l’ARN total dans un tampon de chargement, la séparation de taille par électrophorèse de gel, le transfert de l’ARN à une membrane, le lien croisé de l’ARN sur la membrane et l’hybridation à l’aide de sondes oligo parés radiolabeled souhaitées.
L’étape critique pour toute…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’accès au laboratoire de rayonnement fourni par l’institut hôte et BRIT pour les radioisotopes. Le laboratoire PVS est soutenu par le National Center for Biological Sciences, le Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) du Department of Biotechnology, Gouvernement de l’Inde. Mp reconnaît DBT-Research Associateship, DBT, Gouvernement de l’Inde.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
参考文献
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
