Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

NOT: Tüm hayvan çalışmaları Cleveland Clinic Lerner Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından yetkilendirilmiş ve onaylanmıştır. 1. Diseksiyon için ortam ve malzeme hazırlayın NOT: Tüm tampon ve ortam tarifleri Tablo 1’de verilmiştir. Bu prosedür, biyogüvenlik kabini olarak adlandırılan bir doku kültüründe steril koşullar altında yapılır. Karışık glia ortamını (MGM) hazırlayın ve sterilize edin. Bu, bir gün önce yapılabilir ve 4 ° C’de saklanabilir. Fibronektin’i sterilH2O ile 1:100 konsantrasyonda seyreltin. Seyreltilmiş fibronektinin hacmi, deney için kullanılan yavru sayısına ve CNS bölgesine bağlı olacaktır. 1 korteks için bir T25 şişe, 2-4 serebella için bir T25 şişe, 2-4 beyin sapı için bir T25 şişe ve 2-4 omurilik için bir T25 şişe kullanın.NOT: Yukarıda listelenen kriterleri kullanarak aynı bölgedeki dokuyu birleştirmek, aşağıda açıklanan protokolü değiştirmeden yeterli ayrışmaya izin verecektir. Adım 1.2’de açıklanandan daha fazla dokunun birleştirilmesi, ayrışma reaktif konsantrasyonlarının daha fazla optimizasyonunu gerektirecektir. Pipet 3 mL seyreltilmiş fibronektin T25 şişelere oda sıcaklığında ve 2 dakika bekletin. Fibronektini aspire edin ve şişelerin şişe kapağı gevşetilerek gece boyunca kurumasına izin verin. 2. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik diseksiyonu NOT: Bu prosedür tezgah üstünde yapılabilir ve diseksiyon kapsamı gerektirir. İşlemin tüm adımları için sıkı aseptik teknik kullanın ve oda havasına doku maruziyetini en aza indirin. Maksimum doku korumasını sağlamak için diseksiyon sırasında tüm ortamları buz üzerinde soğutulmuş halde tutun. Alternatif olarak, bu prosedür bir iç diseksiyon kapsamının kullanılmasına izin veren bir davlumbazda yapılabilir. Tüm alanları% 70 etanol ile silin. 10 cm’lik bir Petri kabına 10 mL PBS/antibiyotik çözeltisi (PAS) pipetin. Her yavru için disseke edilecek bir Petri kabı hazırlayın. Çözeltiyi soğuk tutmak için buz üzerine koyun. Dezenfekte edilmiş bir doku kültürü başlığında, her CNS bölgesi için bir tane olmak üzere 4 ayrı 15 mL konik tüpe 9 mL DMEM (katkı maddesi içermeyen) pipetin, tüp kapaklarını değiştirin ve buz üzerine koyun. Tüplerle buz kovasını diseksiyon kapsamından ulaşacak mesafeye yerleştirin. Adım 2.2’de hazırlanan 10 cm Petri kabını dezenfekte diseksiyon kapsamı aşamasına yerleştirin. Fare yavrusunu kurumsal protokole göre anestezi ve ötenazi yapar ve keskin makasla hızlı bir şekilde kafa keserek kafayı çıkarır.NOT: Doğum sonrası gün (P) 3-5 yavru kullanılır. Yaşlı yavrular daha gelişmiş bir CNS’ye sahiptir ve genişleyen glial hücreler için yeterli bir kaynak olmayabilir. Daha genç yavrular (P) 0-2 daha fazla sayıda glia verebilir ve kullanılabilir; ancak omurilik dokusunun büyüklüğü nedeniyle bu genç yaşta diseke edilmesi çok zordur. Yavrunun cildini% 70 etanol kullanarak temizleyin. İnce makas kullanarak, kutanöz tabakayı hayvanın başının orta çizgisi boyunca kesin, kaudal olarak başlayın ve buruna ulaşana kadar rostral hareket ettirin. Herhangi bir doku hasarını önlemek için kafatasını derinlemesine kesmekten kaçının. Kafayı aşağı doğru açılandırmak, kafatasının her iki tarafına kutanöz tabakayı çekmek ve yay makası kullanmak, kafatası orta hattı boyunca bir kesi yapın, foramen magnumundan başlayarak, yine kaudalden rostral’a kesin. İnce uçlu forsepslerle, kafatası yarısını sağ ve sol taraflara çekerek korteks, beyincik ve beyin sapını açığa çıkarın. Maruz kaldıktan sonra, beyni yavaşça kafatasından çıkarın ve Adım 2.2’de hazırlanan 10 cm’lik Petri kabına kaldırın. Arka beyin bağlı olarak anatomik yapıyı korumak için beynin hasar görmediğinden emin olun. Forsepslerin noktası yukarı bakacak şekilde ince, kavisli uçlu forseps kullanarak, beyinciği sıkıştırın. Meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin. Beyin sapının doğrudan beyinciğin ventral olduğundan ve beyincik çıkarıldıktan sonra görülebildiğinden emin olun. İnce uçlu forsepslerle çıkarın, meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin. Orta beyni korteksten ayırın, kortikal meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin. Omuriliği çıkarmak için, kafası kesilmiş fare yavrusunu sırtüstü pozisyonda (yukarı doğru uzanan) yerleştirin ve kopmuş vertebral kolon araştırmacıya doğru yükseltilir. % 70 etanol ile tekrar püskürtün. Vertebral kolonun yanal tarafları boyunca, rostral ila kaudal yönde, göğüs kafesinden arka bacaklara ulaşana kadar kesin. Kesim yaparken, vertebral kolon görünene kadar iç organları geri itin. Vertebral kolonun her bir yan tarafı boyunca izole edilene kadar kesin ve Adım 2.2’de hazırlanan 10 cm’lik Petri kabına yerleştirin. Ventral tarafı yukarı, ince yay makası kullanarak, omurilik dokusunu açığa çıkarmak için bel bölgesine ulaşana kadar her omurların sağ ve sol taraflarını alternatif olarak kesin. Omuriliği ve meninksleri diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu forseps ile nazikçe çıkarın. Buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin. Her yavru için 2.5.-2.19 adımlarını tekrarlayın ve hazırlanan her T25 şişesi için adım 1.2’de belirtilen kriterlere uyacak şekilde aynı bölgedeki dokuyu birleştirin.NOT: Meninksleri mümkün olduğunca tamamen çıkarın. Önemli miktarda meninks kalırsa, meningeal hücrelerin fibroblast benzeri fenomeni büyüyecek ve hücre kültürünü ezecektir. Eşit fenotipteki çoklu omurilikler, spesifik bir hücre kültürü oluşturmak için birleştirilebilir. Hücrelerin aşırı kalabalıklaşmasının meydana gelmediğinden emin olun, bu da glial apoptoza ve diferansiyel fenotiplere yol açabilir. 3. Doku ayrışması NOT: Aşağıdaki tüm prosedürler, aseptik teknik ve steril malzemeler kullanılarak biyogüvenlik kabini olarak belirlenmiş steril doku kültüründe gerçekleştirilir. Doku lizisine başlamak için her 15 mL’lik 9 mL DMEM konik tüpüne ve dokuya 0.53 mM EDTA içeren 1 mL% 0.05 tripsin ekleyin.NOT: DMEM, tripsin inhibitörü olarak işlev görebilen yüksek miktarda kalsiyum klorür içerir. Belirtilen adımları izleyerek ayrışma tamamlanmazsa, Hanks’in kalsiyum veya magnezyum içermeyen Dengeli Tuz Çözeltisi kullanılabilir. Tripsinizasyondan sonra, enzim bir tripsin inhibitörü eklenerek nötralize edilebilir, ancak sonraki adımlarda kullanılan DNaz I için bir kofaktör olduğu için çözeltiye kalsiyum tekrar eklenmelidir. 10 mL’lik bir pipetle yaklaşık 20x tritüratlayın. Hücre süspansiyonlarını boş 50 mL konik tüplere aktarın. Çözeltiyi 37 ° C’de, 15 dakika boyunca% 5 CO2’de inkübe edin, 8 dakika sonra lizatları hafifçe çalkalayın. 50 μg / mL’lik bir son konsantrasyon için her tüpe 5 mL MGM ve 200 μL (5 mg / mL) DNaz I ekleyin. Her lizatı 10 mL’lik pipet 10x ile tritüre edin. Ayrışmamış dokunun tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için hücre süspansiyonlarının oda sıcaklığında 3 dakika oturmasına izin verin. Hücre süspansiyonlarını yeni 50 mL konik tüplere aktarın ve ayrışmamış dokuyu geride bırakın.NOT: Yukarıda açıklanan lizis ve tritürasyon adımları, ayrışmamış doku miktarını önemli ölçüde sınırlar. Tüpleri frensiz 4 °C’de 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve kalan hücre peletlerini 5 mL MGM’de yeniden askıya alın. Peleti 5 mL pipet 20x ile tritüre edin. 5 mL hücre süspansiyonlarını kaplamalı T25 şişelere plakalayın. Hücreleri 37 ° C’de,% 5 CO2’de inkübe edin ve hücre kalıntılarını gidermek için başlangıçta 24 saat sonra ortamı değiştirin.NOT: Bazı protokoller 72 saatten sonra ilk ortam değişikliğini önerir. Bu adımın optimizasyonu gerekebilir. MGM ile hücreler% 80 kaynaşana kadar (yaklaşık 5-7 gün) her 48-72 saatte bir% 100 ortam değişikliği yapın.NOT: Ortam değişmeden önce tüm ortamlar 37 °C’ye ısıtılmalıdır. 4. Mikroglia izolasyonu Karışık glia kültürleri% 80 akıcılığa ulaştığında, kapakları sıkarak ve parafin filmle kapatarak sallamak için şişeler hazırlayın. Mikroglia’yı karışık glial kültürlerden çıkarmak için, şişeleri 37 ° C’lik bir inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yatay olarak sabitleyin. Şişeleri 1 saat boyunca 15 x g’de sallayın. Ortam ve pipeti 15 mL’lik konik bir tüpe çıkarın. Şişeleri 3 mL ılık MGM ile iki kez durulayın, 15 mL konik tüplere yıkama ekleyin. Bunlar mikroglia. Kültür şişelerine 5 mL sıcak, taze MGM ekleyin. Şişeleri parafin filmle yeniden kapatın, şişeleri çalkalayıcı üzerinde yatay olarak sabitleyin ve OPC’lerin astrositlerden ayrılması için 15 saat boyunca 37 ° C’de 15 x g’de çalkalayın.NOT: Bu adım gece boyunca yapılabilir, ancak 15 saatlik sarsıntı süresi kritik öneme sahiptir, çünkü fazla zaman hücre ölümüne neden olabilir. Süpernatantı adım 4.3’ten itibaren santrifüj edin. 3 dakika boyunca 300 x g’da ve standart protokollere göre kültür mikroglia16 veya biyolojik bir tahlil için kullanın. 5. Oligodendrosit öncü hücre izolasyonu NOT: OPC’leri ilk izolasyondan sonra kaplarken, poli-D-lizin kaplı bir yüzeye (steril plaka veya kapak kayması) kaplanmalıdır. Bu bölümü tamamlamadan önce bu materyalleri hazırlayın. 15 saatlik sallamanın ardından, süpernatantı şişelerden çıkarın ve steril 100 mm Petri kabı üzerindeki plakayı çıkarın. Süpernatantı 37 ° C’de, 30 dakika boyunca% 5 CO2’de kuluçkaya yatırın, kalan mikroglia’yı çıkarmak için 15 dakika sonra döndürün, çünkü bunlar yemeğe çok hızlı bir şekilde yapışacaktır. Bu adım için doku kültürü ile tedavi edilmemiş Petri kapları kullanılabilir. Poli-D-lizin kaplı bir yüzeydeki yapışkan olmayan hücre süpernatanı, sayımını ve plakasını çıkarın. Tipik olarak, 7.500-10.000 OPC kaplanır /cm2. 37 °C’de, en az 1 saat (6 saate kadar) için% 5 CO2’yi inkübe edin, ardından ortamın% 95’ini yavaşça aspire edin ve OPC’lerin bozulmasını en aza indirmek için ortamı kuyunun duvarına pipetleyerek yavaşça sıcak OPC Ortamı ekleyin. Hücreler kullanıma hazır olana kadar medyayı her 48 saatte bir değiştirin.NOT: Aynı anda yalnızca bir kuyunun değiştirilmesi çok önemlidir. OPC’ler hassastır ve özellikle kuru koşullara karşı toleranssızdır. OPC ortamına PDGF-AA’nın eklenmesi, OPC olgunlaşmasını oligodendrositlere geciktirmektir. Bu faktör, deneysel odak olgun oligodendrositler ise kültür medyasından dışlanabilir. 6. Astrosit izolasyonu 15 saatlik sallamanın ardından, süpernatantı çıkarın ve şişeleri ılık 1x PBS ile 2x durulayın. 0.53 mM EDTA içeren 4 mL% 0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C’de,% 5 CO2’de 5 dakika veya hücreler kalkana kadar inkübe edin. Astrositlerin kalktığından emin olmak için, standart bir geniş alan mikroskobu kullanarak onları görselleştirin. Astrositler tripsinizasyondan sonra küresel olarak görünecektir. Astrositler ayrıldıktan sonra, şişeyi dikey olarak durun ve 4 mL MGM ekleyin. Karıştırmak için tritürat. Pipet astrositleri 15 mL’lik konik bir tüpe yerleştirin, 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Astrosit Ortamındaki astrositleri ve fibronektin kaplı yüzeydeki plakayı adım 1.2’de açıklandığı gibi yeniden askıya alın. veya biyolojik tahlil için kullanın.NOT: 20 ng / mL murin fibroblast büyüme faktörü, astrosit kültürünün oluşturulmasına yardımcı olmak için ilk ortam değişikliği sırasında eklenebilir. Ek olarak, standart jelatin kaplama, fibronektin’e düşük maliyetli bir alternatif olabilir. 7. İmmünositokimya kullanılarak mikroglia, OPC’ler, astrositler ve olgun oligodendrositlerin tanımlanması ve izolasyonu Kaplanmış hücreler uygun akıcılığa ulaştığında, ortamı nazikçe çıkarın ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak yapışkan hücreleri sabitleyin. Bu adımı bir biyogüvenlik kabininde yapın.NOT: Aspire ederken veya çözelti eklerken, hücre ayrılmasını önlemek için hafif basınçlı pipet. PFA’yı yavaşça aspire edin, ardından hücreleri 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kat yıkayın. 1x PBS’de% 10 serum ve% 0.1 Triton X-100 kullanarak uygun blokaj çözeltisi hazırlayın.NOT: Serum kaynağı, sekonder antikorun yükseldiği konakçı hayvanı yansıtır. Örneğin, ikincil antikor keçi anti-tavşanı ise, uygun bloke edici serum normal keçi serumudur. Aynı şekilde, ikincil antikor eşek anti-tavşanı ise, bloke edici serum normal eşek serumu olmalıdır. Hücreler tamamen kaplanana kadar bloke edici çözelti ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin. Bir antikor seyreltici çözeltisi hazırlayın (9 mL 1x PBS, 0.01 g sığır serum albümini, 30 μL Triton X-100). Alternatif olarak, antikorlar adım 6.3’te açıklanan blokaj çözeltisinde seyreltilebilir. Antikor seyreltici veya bloke edici çözeltide aşağıdakilere özgü birincil antikorları seyreltin:Mikroglia: 1:250 seyreltmede (2.4 μg / mL) iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1). OPC’ler: 1:200 seyreltmede (5 μg / mL) nöral / glial antijen 2 (NG2). Olgun oligodendrositler: 1:400 seyreltmede miyelin bazik proteini (MBP) (konsantrasyon çok bağımlıdır ve optimizasyon gerekli olabilir). Astrositler: 1:400 seyreltmede glial fibriler asidik protein (GFAP) (0.25 μg / mL)17.NOT: Aynı türde yetiştirilen birincil antikorları karıştırmayın.NOT: GFAP beyaz cevher astrositlerini güvenilir bir şekilde etiketleyecektir. Gri madde astrositleri için alternatif bir işaretleyici kullanılması gerekebilir. Primer antikoru gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin (hafif ajitasyon tercih edilir). Birincil antikoru çıkarmak için 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın. Uygun sekonder antikorlara sahip hücreleri, ışıktan korunan antikor seyrelticisinde veya bloke edici çözeltide 1:400 seyreltmede inkübe edin.NOT: Sekonder antikorlar, mevcut mikroskop parametrelerine bağlı olarak değiştirilebilen bir florofora konjuge edilir. Floresan sekonder antikorlar uygulandıktan sonra, mümkün olduğunca ışıktan koruyun. Sekonder antikoru oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe ederek ışığa maruz kalmayı sınırlayın. Fazla sekonder antikoru çıkarmak için 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Çekirdekleri etiketlemek için 1:1.000 DAPI/PBS çözeltisi kullanın ve karanlıkta oda sıcaklığında hücreleri 5 dakika boyunca inkübe edin. Karanlıkta 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın. Montaj için, montaj ortamını uygulayın ve görüntülemeden önce karanlıkta kurumaya bırakın.NOT: Monte edilmiş kızaklar oda sıcaklığında 2-3 gün saklanabilir. Uzun süreli depolama için slaytları 4 °C’ye taşıyın. Maksimum sinyal için bir hafta içinde görüntü. Tüm temsili görüntüler konfokal mikroskopta görüntülenmiştir; Bununla birlikte, ters floresan mikroskoplar da önerilir.