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神経科学

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

Published: June 04, 2020
doi:
10.3791/61345
,
1Department of Neurosciences,Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation, 2Brain Health Research Institute,Kent State University

概要

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Abstract

Os métodos aqui apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para a dissecção de quatro diferentes regiões do sistema nervoso central (SNC) de neonatos murinos para o isolamento de subpopulações gliais. O objetivo do procedimento é dissociar a micróglia, as células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) e os astrócitos dos tecidos corticais, cerebelares, do tronco encefálico e da medula espinhal para facilitar análises in vitro adicionais. Os procedimentos de isolamento da região do SNC permitem a determinação da heterogeneidade regional entre a glia em múltiplos sistemas de cultura celular. O isolamento rápido da região do SNC é realizado, seguido pela remoção mecânica das meninges para evitar a contaminação das células meníngeas da glia. Este protocolo combina dissociação tecidual suave e chapeamento em uma matriz especificada projetada para preservar a integridade e a aderência celular. O isolamento de glia mista de várias regiões do SNC fornece uma análise abrangente da glia potencialmente heterogênea, maximizando o uso de animais experimentais individuais. Além disso, após a dissociação do tecido regional, a glia mista é dividida em vários tipos de células, incluindo microglia, OPCs e astrócitos para uso em qualquer tipo de célula única, inserções de placas de cultura celular ou sistemas de cocultura. No geral, as técnicas demonstradas fornecem um protocolo abrangente de ampla aplicabilidade para a dissecção cuidadosa de quatro regiões individuais do SNC de neonatos murinos e inclui métodos para o isolamento de três tipos individuais de células glia para examinar a heterogeneidade regional em qualquer número de sistemas ou ensaios de cultura celular in vitro.

Introduction

A glia é necessária para a função neuronal adequada no SNC. São compostas por três grandes subpopulações, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia, cada uma com um papel diferente, porém indispensável1. Sem a diversidade e a atividade das células gliais adequadas, a função neuronal seria severamente afetada, levando ao comprometimento do SNC. As glias são capazes de influenciar a neurotransmissão, e cada tipo de célula o faz de uma maneira única. As células gliais do cérebro têm a capacidade de se comunicar entre si, bem como com as células neuronais, a fim de facilitar a função adequada do SNC2. Os oligodendrócitos aumentam a velocidade de transmissão elétrica através da formação de uma bainha de mielina, o que facilita o agrupamento de canais iônicos nos nós de Ranvier, os locais de geração do potencial de ação neuronal3. As micróglias são críticas para a poda das sinapses, monitorando a transmissão sináptica e “reconectando” as conexões neuronais após a lesão4. Além disso, a micróglia é a célula imune residente mais abundante do SNC, atuando como a principal forma de defesa do hospedeiro contra patógenos5. Os astrócitos podem regular a transmissão sináptica entre neurônios modificando a concentração de potássio extracelular6. Eles também têm papéis no controle do fluxo sanguíneo local7, liberando e absorvendo elementos neuromoduladores8, e têm um papel fundamental na manutenção da barreira hematoencefálica9. Assim, cada subtipo glial é crítico para a função do SNC, pois defeitos em qualquer tipo têm sido associados a uma ampla variedade de estados patológicos, incluindo doenças psiquiátricas, epilepsia e condições neurodegenerativas10.

O maior obstáculo no estudo da patobiologia do SNC é a incapacidade de investigar células humanas no contexto de seu nicho microambiental. O tecido da biópsia humana é mais coletado post-mortem e as células podem ser facilmente danificadas ou perdidas durante a extração e o processamento. Além disso, é um desafio manter as células humanas vivas e viáveis in vitro por qualquer período de tempo sem derivar linhagens celulares imortalizadas de tumores, momento em que elas não refletem mais com precisão suas propriedades fisiológicas normais11,12. Além disso, há uma quantidade significativa de heterogeneidade regional entre os tipos individuais de células gliais13,14,15, e a obtenção de amostras regionais do SNC de pacientes individuais é quase impossível. Como tal, é necessário desenvolver modelos alternativos para estudar a contribuição da glia regional em distúrbios específicos do SNC.

Aqui, descrevemos um sistema in vitro usando o isolamento específico da região do SNC de camundongos de múltiplas subpopulações gliais, permitindo a manipulação e quantificação de microglia, células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), que dão origem a oligodendrócitos maduros e astrócitos. Cada população pode ser isolada de forma independente e submetida a uma ampla variedade de técnicas experimentais, incluindo tratamento de drogas ou moléculas, imunocitoquímica, extração e análise de proteínas/RNA e outros sistemas de cocultura, dependendo da necessidade experimental. Além disso, essa técnica de isolamento produz alto número de células, permitindo a caracterização e investigação de cada população glial de maneira de alto rendimento. Também permite o estudo da diferenciação, crescimento e proliferação de células do SNC em resposta a uma ampla variedade de estímulos microambientais de forma controlada, a fim de evitar fatores de confusão que estão tipicamente presentes em um ambiente in vivo. Por fim, esta técnica de isolamento celular facilita a manipulação de populações de células gliais dentro de diferentes regiões do SNC para investigar como a glia regional interage entre si e responde a estímulos variados, permitindo precisão e reprodutibilidade.

Protocol

NOTA: Todos os estudos em animais foram autorizados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Cleveland Clinic Lerner Research Institute. 1. Preparar meios e suprimentos para dissecação NOTA: Todas as receitas de buffer e mídia são fornecidas na Tabela 1. Este procedimento é feito em condições estéreis em um gabinete de biossegurança designado por cultura de tecidos. Preparar e filtrar estérile o meio de glia mista (MGM). Isso pode ser feito no dia anterior e armazenado a 4 °C. Diluir a fibronectina numa concentração de 1:100 com H2O estéril. O volume de fibronectina diluída dependerá do número de filhotes e da região do SNC utilizada para o experimento. Use um frasco T25 para 1 córtex, um frasco T25 para 2-4 cerebeles, um frasco T25 para 2-4 caules cerebrais e um frasco T25 para 2-4 medula espinhal.NOTA: A combinação de tecido da mesma região utilizando os critérios listados acima permitirá uma dissociação adequada sem alterar o protocolo descrito abaixo. A combinação de mais tecido do que o descrito na Etapa 1.2 exigirá uma otimização adicional das concentrações de reagentes de dissociação. Pipetar 3 ml de fibronectina diluída para balões T25 à temperatura ambiente e deixar descansar durante 2 min. Aspirar a fibronectina e deixar secar os frascos durante a noite com a tampa do balão solta. 2. Córtex, cerebelo, tronco encefálico e dissecção da medula espinhal NOTA: Este procedimento pode ser feito na bancada e requer um escopo de dissecação. Use uma técnica asséptica rigorosa para todas as etapas do procedimento e minimize a exposição do tecido ao ar ambiente. Mantenha todos os meios resfriados no gelo durante a dissecção para garantir a máxima preservação do tecido. Alternativamente, esse procedimento pode ser feito em um exaustor que permita o uso de um escopo de dissecação interna. Limpe todas as áreas com etanol a 70%. Pipetar 10 mL de PBS/solução antibiótica (PAS) em uma placa de Petri de 10 cm. Prepare uma placa de Petri para cada filhote a ser dissecado. Coloque no gelo para manter a solução resfriada. Em um exaustor de cultura de tecidos desinfetados, pipete 9 mL de DMEM (sem aditivos) em 4 tubos cônicos separados de 15 mL, um para cada região do SNC, substitua as tampas do tubo e coloque no gelo. Coloque o balde de gelo com tubos a uma curta distância do escopo de dissecação. Colocar uma placa de Petri de 10 cm preparada no passo 2.2 na fase de escoamento da dissecação desinfetada. Anestesiar e eutanasiar filhotes de camundongos de acordo com o protocolo institucional e remover a cabeça por decapitação rápida com tesoura afiada.NOTA: Dia pós-natal (P) 3-5 filhotes são usados. Filhotes mais velhos têm um SNC mais desenvolvido e podem não ser uma fonte adequada de expansão das células gliais. Filhotes mais jovens (P) 0-2 podem produzir um maior número de glias e podem ser usados; no entanto, o tecido da medula espinhal é muito difícil de dissecar nesta idade jovem devido ao tamanho. Limpe a pele do filhote usando etanol a 70%. Usando uma tesoura fina, corte a camada cutânea ao longo da linha média da cabeça do animal, iniciando caudalmente e movendo-se rostral, até chegar ao focinho. Evite cortar profundamente o crânio para evitar qualquer dano tecidual. Inclinando a cabeça para baixo, puxe a camada cutânea para cada lado do crânio e usando uma tesoura de mola, faça uma incisão ao longo da linha média do crânio, começando pelo forame magno, novamente cortando caudal a rostral. Com pinças de ponta fina, puxe as metades do crânio para os lados direito e esquerdo, expondo o córtex, o cerebelo e o tronco encefálico. Uma vez exposto, levante suavemente o cérebro para fora do crânio e para a placa de Petri de 10 cm preparada na Etapa 2.2. Certifique-se de que o cérebro permaneça intacto para preservar a estrutura anatômica, com o rombencéfalo ligado. Usando pinças finas e curvas com o ponto da pinça voltada para cima, pinch o cerebelo. Retire as meninges e coloque em tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo. Certifique-se de que o tronco encefálico é diretamente ventral ao cerebelo e é visível após a remoção do cerebelo. Removê-lo com pinça de ponta fina, remover meninges e colocar em tubo cônico designado 15 mL no balde de gelo. Separe o mesencéfalo do córtex, remova as meninges corticais e coloque no tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo. Para remover a medula espinhal, coloque o filhote de rato decapitado em decúbito dorsal (deitado de bruços para cima) com a coluna vertebral cortada elevada em direção ao investigador. Pulverize novamente com etanol a 70%. Corte ao longo dos lados laterais da coluna vertebral, no sentido rostral a caudal, através da caixa torácica até atingir os membros posteriores. Durante o corte, empurre para trás os órgãos internos até que a coluna vertebral seja visível. Cortar ao longo de cada lado lateral da coluna vertebral até que esteja isolado e colocar na placa de Petri de 10 cm preparada na Etapa 2.2. Com o lado ventral para cima, usando uma tesoura de mola fina, alterne o corte dos lados direito e esquerdo de cada vértebra até atingir a região lombar para expor o tecido medular. Remova suavemente a medula espinhal e as meninges com pinças de ponta fina sob o microscópio de dissecação. Coloque no tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo. Repetir os passos 2.5.-2.19 para cada filhote, combinando tecido da mesma região de modo a se adequarem aos critérios descritos no passo 1.2 para cada balão T25 preparado.NOTA: Remova as meninges o mais completamente possível. Se uma quantidade significativa de meninges permanecer, o fenótipo semelhante a fibroblastos das células meníngeas irá crescer mais e sobrecarregar a cultura celular. Múltiplas medula espinhal, de fenótipo igual, podem ser combinadas para gerar uma cultura celular específica. Tome cuidado para garantir que a superlotação das células não ocorra, o que pode levar à apoptose glial e fenótipos diferenciais. 3. Dissociação tecidual NOTA: Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança designado por cultura de tecidos estéreis usando técnica asséptica e materiais estéreis. Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM EDTA a cada tubo cônico de 15 mL de DMEM de 9 mL e tecido para iniciar a lise tecidual.NOTA: DMEM contém uma grande quantidade de cloreto de cálcio, que pode atuar como um inibidor da tripsina. Se a dissociação não estiver completa seguindo as etapas descritas, a Solução Salar Balanceada de Hanks sem cálcio ou magnésio pode ser usada. Após a tripsinização, a enzima pode ser neutralizada pela adição de um inibidor de tripsina, embora o cálcio deva ser adicionado de volta à solução, pois é um cofator para a DNase I, que é usado nas etapas subsequentes. Triturar com uma pipeta de 10 mL aproximadamente 20x. Transfira as suspensões celulares para tubos cônicos vazios de 50 mL. Incubar a solução a 37 °C, CO2 a 5% durante 15 min, agitando suavemente os lisados após 8 min. Adicionar 5 mL de MGM e 200 μL (5 mg/mL) de DNase I a cada tubo para uma concentração final de 50 μg/mL. Triturar cada lisado com uma pipeta de 10 mL 10x. Deixe as suspensões celulares ficarem por 3 minutos à temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo dos tubos. Transfira as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mL, deixando para trás o tecido não dissociado.NOTA: As etapas de lise e trituração descritas acima limitam significativamente a quantidade de tecido não dissociado. Centrifugar os tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sem travagem. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os pellets celulares restantes em 5 mL de MGM. Triturar o pellet com uma pipeta de 5 mL 20x. Chapear as suspensões celulares de 5 ml em balões T25 revestidos. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 e trocar o meio inicialmente após 24 h para remover os detritos celulares.Observação : alguns protocolos recomendam uma alteração de mídia inicial após 72 h. A otimização desta etapa pode ser necessária. Realize uma troca de mídia de 100% com MGM a cada 48-72 h até que as células estejam 80% confluentes (aproximadamente 5-7 dias).NOTA: Todos os suportes têm de ser aquecidos a 37 °C antes de serem alterados pelos suportes. 4. Isolamento da micróglia Uma vez que as culturas mistas de glia tenham atingido 80% de confluência, prepare frascos para agitação apertando as tampas e selando com filme de parafina. Para remover a micróglia de culturas gliais mistas, fixar os frascos horizontalmente num agitador orbital no interior de uma incubadora a 37 °C. Agitar os balões a 15 x g durante 1 h. Remova o meio e a pipeta em um tubo cônico de 15 mL. Enxaguar os frascos duas vezes com 3 mL de MGM morno, adicionando lavagem aos tubos cônicos de 15 mL. Estes são os micróglios. Adicionar 5 ml de MGM quente e fresca aos frascos de cultura. Voltar a selar os frascos com película de parafina, fixar os frascos horizontalmente no agitador e agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separação dos OPC dos astrócitos.NOTA: Esta etapa pode ser feita durante a noite, mas o tempo de agitação de 15 horas é crítico, pois o excesso de tempo pode resultar em morte celular. Centrifugar o sobrenadante a partir do passo 4.3. a 300 x g por 3 min e cultura de micróglia de acordo com os protocolos padrão16 ou uso para um ensaio biológico. 5. Isolamento celular precursor de oligodendrócitos NOTA: Ao chapear OPCs após o isolamento inicial, eles devem ser banhados em uma superfície revestida de poli-D-lisina (placa estéril ou deslizamento da tampa). Prepare esses materiais antes da conclusão desta seção. Após agitação de 15 h, retirar o sobrenadante dos frascos e da placa em placa de Petri estéril de 100 mm. Incubar o sobrenadante a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min, rodopiando após 15 min para remover a micróglia restante, uma vez que estas aderirão muito rapidamente ao prato. Placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos podem ser usadas para esta etapa. Remova o sobrenadante, a contagem e a placa de células não aderentes em uma superfície revestida de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPCs são chapeados/cm2. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 1 h (até 6 h), em seguida, aspirar suavemente 95% da mídia e adicionar lentamente a mídia OPC quente, pipetando a mídia contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs. Troque a mídia a cada 48 horas até que as células estejam prontas para uso.NOTA: É fundamental que apenas um poço seja alterado de cada vez. Os OPCs são sensíveis e são especialmente intolerantes a condições secas. A adição de PDGF-AA em meios OPC é para retardar a maturação do OPC em oligodendrócitos. Este fator pode ser excluído dos meios de cultura se o foco experimental forem oligodendrócitos maduros. 6. Isolamento de astrócitos Após 15 h de agitação, retire o sobrenadante e enxágue os frascos 2x com 1x PBS morno. Adicionar 4 ml de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM EDTA e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 5 min ou até que as células tenham levantado. Para garantir que os astrócitos tenham levantado, visualize-os usando um microscópio de campo largo padrão. Os astrócitos aparecerão esféricos após a tripsinização. Uma vez que os astrócitos tenham se desprendido, coloque o frasco verticalmente e adicione 4 mL de MGM. Triturar para misturar. Pipetar astrócitos para um tubo cônico de 15 mL, centrífuga a 300 x g por 5 min. Ressuspender astrócitos em meio e placa de astrócitos na superfície revestida de fibronectina, conforme descrito na etapa 1.2. ou uso para ensaio biológico.NOTA: 20 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos murinos podem ser adicionados durante a primeira mudança de meio para ajudar a estabelecer a cultura de astrócitos. Além disso, o revestimento de gelatina padrão pode ser uma alternativa de baixo custo à fibronectina. 7. Identificação e isolamento de micróglia, OPCs, astrócitos e oligodendrócitos maduros usando imunocitoquímica Uma vez que as células chapeadas tenham atingido a confluência apropriada, remova suavemente os meios e fixe as células aderentes usando paraformaldeído a 4% (PFA) por 10 min. Faça esta etapa em um gabinete de biossegurança.NOTA: Ao aspirar ou adicionar soluções, pipetar com pressão suave para evitar o descolamento da célula. Aspirar lentamente o PFA e, em seguida, lavar as células 3x com 1x PBS por 5 min. Preparar a solução de bloqueio apropriada usando soro a 10% e Triton X-100 a 0,1% em PBS 1x.NOTA: A fonte sérica reflete o animal hospedeiro no qual o anticorpo secundário foi levantado. Por exemplo, se o anticorpo secundário for anti-coelho de cabra, o soro bloqueador apropriado é o soro de cabra normal. Da mesma forma, se o anticorpo secundário for anticoelho de burro, o soro bloqueador deve ser um soro de burro normal. Adicione a solução de bloqueio até que as células estejam completamente cobertas. Bloco por 1 h à temperatura ambiente. Preparar uma solução diluente de anticorpos (9 mL de 1x PBS, 0,01 g de albumina sérica bovina, 30 μL de Triton X-100). Em alternativa, os anticorpos podem ser diluídos na solução de bloqueio descrita no passo 6.3. Diluir os anticorpos primários específicos para os seguintes em solução diluente ou bloqueadora de anticorpos:Microglia: molécula 1 do adaptador de ligação ao cálcio ionizado (Iba1) a uma diluição de 1:250 (2,4 μg/mL). OPCs: antígeno neural/glial 2 (NG2) em diluição de 1:200 (5 μg/mL). Oligodendrócitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) a uma diluição de 1:400 (a concentração é dependente do lote e a otimização pode ser necessária). Astrócitos: proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diluição de 1:400 (0,25 μg/mL)17.NOTA: Não misture anticorpos primários criados na mesma espécie.NOTA: A GFAP rotulará de forma confiável os astrócitos da substância branca. Para os astrócitos da substância cinzenta, pode ser necessário utilizar um marcador alternativo. Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C (com agitação suave é preferível). Lave 3x com 1x PBS por 5 min para remover o anticorpo primário. Incubar células com anticorpos secundários apropriados a uma diluição de 1:400 em diluente de anticorpos ou solução bloqueadora protegida da luz.NOTA: Os anticorpos secundários são conjugados a um fluoróforo que pode ser trocado dependendo dos parâmetros de microscópio disponíveis. Uma vez que os anticorpos secundários fluorescentes tenham sido aplicados, proteja-se da luz o máximo possível. Incubar anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente, limitando a exposição à luz. Lave 3 vezes com 1x PBS por 5 min para remover o excesso de anticorpos secundários. Para marcar núcleos, use uma solução DAPI/PBS 1:1.000 e incube as células por 5 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave 3x com 1x PBS por 5 min no escuro. Para montar, aplique o meio de montagem e deixe secar no escuro antes da imagem.NOTA: As lâminas montadas podem ser armazenadas à temperatura ambiente por 2-3 dias. Para armazenamento a longo prazo, mova as corrediças para 4 °C. Imagem dentro de uma semana para sinal máximo. Todas as imagens representativas foram fotografadas em microscópio confocal; no entanto, microscópios fluorescentes invertidos também são recomendados.

Representative Results

Os dados representativos mostrados abaixo ilustram que a sinalização IFNγ influencia a diferenciação e a maturação do OPC. Sem a presença do receptor IFNγ (IFNγR), as OPCs corticais não se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros tão prontamente, o que é evidenciado pela ausência de coloração de PAM (Figura 1). Como oligodendrócitos e astrócitos são derivados de um progenitor comum, analisamos a expressão de GFAP, que rotula os astrócitos. Descobrimos que as células deficientes em IFNγR expressam fortemente a GFAP, sugerindo que podem estar adotando um fenótipo astrocítico, corroborando relatos anteriores19. Evidências adicionais de heterogeneidade regional em células do SNC são evidenciadas pela morfologia variada dos astrócitos, como visto em astrócitos do córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal (Figura 2). Digno de nota, astrócitos da mesma região também podem apresentar heterogeneidade morfológica, apoiando a noção de que este subtipo glial é altamente dinâmico. As diferenças na arquitetura celular são sugestivas de diversidade funcional e, portanto, a capacidade de isolar populações gliais é necessária para estudar as respostas fenotípicas na ausência e presença de estímulos microambientais. Os oligodendrócitos são críticos para a mielinização dos axônios neuronais e são necessários para o reparo e a função adequados do SNC. Os OPCs dão origem às suas contrapartes maduras, tornando fundamental entender a biologia por trás de sua capacidade de diferenciar. A sinalização de citocinas influencia significativamente o comportamento das células-tronco e do sistema imunológico. Assim, é importante compreender como as respostas regionais das OPCs podem variar para a estimulação diferencial de citocinas (Figura 3), o que pode afetar sua capacidade de se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes maduros. Figura 1: Dados representativos mostrando a diferenciação do OPC em camundongos WT e IFNγR-/- na presença de IFNγ exógeno. OPCs corticais foram isolados de filhotes de camundongos (A ) WT e (B) IFNγR-/- P4 seguindo o procedimento descrito acima. As células foram tratadas com 1 ng/mL de IFNγ por 48 h, depois fixadas e coradas para delinear a diferenciação celular. OPCs foram marcadas para NG2 e GFAP para identificar aqueles que estavam adotando um fenótipo astrocítico. Da mesma forma, OPCs também foram marcados para NG2 e MBP para identificar aqueles que estavam se diferenciando em oligodendrócitos maduros. Barra de escala = 20 μM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Dados representativos demonstrando heterogeneidade regional na morfologia dos astrócitos. Astrócitos do córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal foram isolados de filhotes de camundongos P4 usando o protocolo descrito acima e marcados para GFAP (verde) por imunocitoquímica após 48 h em cultura. Barra de escala = 20 μM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Dados representativos demonstrando respostas diferenciais de OPCs regionais às citocinas. OPCs foram isolados do tronco encefálico e da medula espinhal de filhotes de camundongos P4 usando o protocolo descrito acima. As células foram tratadas com concentrações crescentes (1-10 ng/mL) de ( A ) IFNγ ou (B) interleucina (IL) -17, a fim de investigar a influência diferencial da citocina na capacidade das OPCs regionais de se diferenciarem em oligodendrócitos mielinizantes. Após uma incubação de 48 h com citocinas especificadas, as OPCs foram fixadas e marcadas para NG2 (verde) e MBP (vermelho). Barra de escala = 20 μM. Os dados representam médias ± EPM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 por ANOVA de 2 vias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. PBS/Solução Antibiótica (PAS): 1,0 mL 100X Antibiótico/Antimicótico contendo 10.000 unidades/mL de penicilina e 10.000 mg/mL de estreptomicina 25 mg/mL Anfotericina B 99 mL 1X PBS Mídia de Glia Mista (MGM) 88 mL 1X DMEM (glicose elevada, c/L-glutamina, c/Na piruvato) 10 mL FBS inativado pelo calor 1,0 mL L-Glutamina (100X) 1,0 mL Antibiótico/Antimicótico Meios OPC (50mL) 49 mL Meios neurobasais 1,0 mL Suplemento de B27 (50X) 10 ng/ml PDGF-AA NOTA: PDGF-AA é adicionado fresco antes de cada alteração de mídia. Meios de astrócitos (1 L) 764 mL MEM com sais de Earle contendo glutamina 36 mL Glicose (utilizar estoque de 100 mg/mL para a concência final de 20 mM) 100 mL FBS inativado pelo calor 100 mL Soro de cavalo inativado pelo calor 10 mL Glutamina (utilizar 200 mM de existências se não estiver incluída no meio de existência) OPCIONAL: 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico recombinante de camundongo NOTA: Filtro estéril de todos os suportes e conservar a 4°C até serem utilizados. Tabela 1: Buffer e receitas de mídia.

Discussion

Neste protocolo, descrevemos o isolamento das três principais subpopulações de células gliais do SNC de camundongos: micróglia, OPCs e astrócitos. Um grande revés para a investigação de doenças neurodegenerativas e neuroinflamatórias do SNC é a falta de células e tecidos humanos primários, particularmente aqueles que são regionais e do mesmo paciente. Na maioria dos casos, as linhagens celulares humanas do SNC são derivadas de células cancerígenas transformadas e imortalizadas que podem não ser representações precisas de seu comportamento fisiológico normal20,21,22. Assim, métodos alternativos são necessários para estudar os fenótipos celulares do SNC de forma controlada. Além disso, a diversidade de populações de células gliais neurológicas torna necessário investigar cada subtipo tanto independentemente um do outro, bem como em condições de co-cultura, a fim de recapitular suas funções celulares autônomas e não autônomas. As células gliais têm uma grande variedade de funções críticas no SNC, desde o suporte neuronal23, aprendizagem/cognição 24,25 e respostas imunológicas do SNC26. Como tal, é necessário compreender as funções moleculares e celulares de cada subpopulação glial em um contexto fisiológico e patológico. Para isso, fornecemos aqui um método confiável para a extração e isolamento de subtipos viáveis de glia. Devido a restrições práticas e éticas na pesquisa do sujeito humano, os modelos animais são atualmente os substitutos mais relevantes para a biologia celular glial humana. Em particular, os ratos são animais modelo ideais, pois seu genoma pode ser manipulado e analisado para dissecar ainda mais os mecanismos moleculares específicos subjacentes à saúde e à doença. Portanto, a remoção e separação bem-sucedidas de micróglias murinas, OPCs e astrócitos é uma ferramenta fundamental para investigar as funções da glia durante condições fisiológicas, neurodegenerativas ou neuroinflamatórias.

Este protocolo pode ser otimizado para explorar a heterogeneidade regional das células do SNC. Está se tornando cada vez mais claro que a glia exibe heterogeneidade regional em forma e função. Os astrócitos são regionalmente diversos e exibem morfologia distinta dependendo de sua localização dentro do CNS27. Além disso, a densidade de astrócitos e seu índice mitótico podem definir regiões anatômicas, apoiando a hipótese de que a heterogeneidade regional de astrócitos pode refletir diferenças moleculares e funcionais com base em sua localização dentro do SNC28. A heterogeneidade regional microglial também está sob investigação ativa, embora os mecanismos subjacentes e as consequências funcionais da diversidade da micróglia no desenvolvimento ou comportamento do SNC sejam atualmente incertos. No entanto, sabe-se que a micróglia adulta apresenta diversidade no número celular, estruturas celulares e subcelulares e assinaturas moleculares29. Além disso, avanços recentes na citometria de massa multiplexada definiram ainda mais a heterogeneidade regional da micróglia, analisando o fenótipo celular de cinco regiões diferentes do SNC de nove doadores humanos, permitindo a imunofenotipagem em larga escala da micróglia humana30. Atualmente, tais abordagens estão em seus estágios iniciais, tornando os estudos em animais uma solução viável para o estudo da glia regional no desenvolvimento da doença do SNC. Finalmente, a heterogeneidade regional também foi recentemente descrita em oligodendrócitos. O sequenciamento de RNA unicelular em 5072 células individuais de 10 regiões do SNC juvenil e adulto identificou 13 subpopulações distintas em diferentes estágios de diferenciação31. É importante ressaltar que, à medida que os oligodendrócitos amadureceram a partir de OPCs, seus perfis transcricionais divergiram e seus fenótipos funcionais mudaram, destacando a heterogeneidade dos oligodendrócitos dentro do SNC31.

Assim, a compreensão da heterogeneidade regional das várias células residentes do SNC no contexto de seus diversos neurônios vizinhos e outras glias pode fornecer uma justificativa importante para o desenvolvimento futuro de novas terapias para tratar distúrbios neuroinflamatórios e neurodegenerativos. Embora este protocolo se concentre na extração, isolamento e identificação de subpopulações gliais, ele fornece um ponto de partida conveniente para o exame de sua função. Além disso, pode ser adaptado e combinado com modelos de camundongos transgênicos, a fim de estudar os mecanismos genéticos associados à biologia celular glial. Também pode ser usado para examinar as respostas das células gliais umas às outras em ensaios de co-cultura. As etapas descritas representam um método econômico e de alto rendimento de extração e isolamento de diferentes populações gliais do SNC, que podem ser adaptadas a uma ampla variedade de parâmetros experimentais. Deve-se notar; no entanto, que o método aqui descrito utiliza neonatos devido aos níveis mais baixos de mielinização e alta densidade de glia proliferante. Por estas razões, é tecnicamente mais viável isolar a glia viável dos neonatos em comparação com os animais adultos. As diferenças fenotípicas na glia neonatal em comparação com a glia adulta devem, portanto, ser consideradas durante o delineamento experimental e a interpretação dos dados.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Morgan Psenicka pela edição e discussão do manuscrito e ao Dr. Grahame Kidd pela assistência na formatação das figuras. Este trabalho foi apoiado pelo NIAID K22 AI125466 (JLW).

Materials

0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA Gibco 25300054 Tissue dissociation
12-Well Plates Greiner Bio-One 665 180 Cell culture plate
1X PBS pH 7.4 Gibco 10010031 Standard reagent
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Fixative
50 mL, 25 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 690 175 Cell culture (T25) flask
Antibiotic-Antimycotic 100X Gibco 15240-096 Media component
B-27 Supplement 50X Gibco 17504-044 Media component
Bovine serum albumin Sigma A9647-50G Antibody diluent
Confocal Microscope Zeiss LSM 800 Confocal for imaging
DAPI ThermoFisher D1306 Nuclear stain
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate Gibco 11995040 Media component
Dnase I Sigma 10104159001 Tissue dissociation
Fetal bovine serum heat inactivated Gibco A3840001 Media component
Fibronectin from bovine plasma Sigma F1141-1MG Cell adherent
Fine stitch Scissors Sklar 64-3260 Dissection tools
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Secondary staining antibody
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 Invitrogen A21434 Secondary staining antibody
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) ThermoFisher 14170120 Tissue dissociation
L-glutamine, 200mM Gibco 20530081 Media component
Murine epidermal growth factor ThermoFisher PMG8044 Media component
Murine IFN-γ Peprotech 315-05-20UG Media component
Murine PDGF-AA Peprotech 315-17 Media component
Neurobasal Gibco 21103-049 Media component
Normal goat serum Sigma G9023 Blocking solution component
Operating Scissors Surgi-OR 95-272 Dissection tools
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning Biocoatt 354086 Cell adherent
Prolong Gold Antifade Reagent Cell Signaling Technology 9071S Mounting Media
Rabbit anti-Iba1 Wako 019-19741 Primary antibody
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan Millipore ab5320 Primary antibody
Rat anti-GFAP ThermoFisher 13-0300 Primary antibody
Rat anti-myelin basic protein Abcam ab7349 Primary antibody
Sharp Tip Scissors Surgi-OR 95-104 Dissection tools
Stereo Microscope Leica S4 E Stereo Zoom Microscope Microscope for dissection
Tissue Forceps Sklar 66-7644 Dissection tools
Triton X-100 Fisher Bioreagents BP151-100 Cell permabilization
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) Sigma 10109878001 Tissue dissociation
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参考文献

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Sinyuk, M., Williams, J. L. Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions. J. Vis. Exp. (160), e61345, doi:10.3791/61345 (2020).
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