כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.
השיטות המוצגות כאן מדגימות נהלי מעבדה לנתיחה של ארבעה אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מילודים מורין לבידוד תת-אוכלוסיות גליה. מטרת ההליך היא לנתק את תאי האב של מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים (OPCs) ואסטרוציטים מרקמת קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וחוט השדרה כדי להקל על ניתוח נוסף במבחנה. נהלי הבידוד של אזור CNS מאפשרים לקבוע הטרוגניות אזורית בקרב גליה במערכות מרובות של תרביות תאים. בידוד מהיר של אזור CNS מבוצע, ואחריו הסרה מכנית של קרום המוח כדי למנוע זיהום תאי קרום המוח של גליה. פרוטוקול זה משלב דיסוציאציה עדינה של רקמות וציפוי על מטריצה מוגדרת שנועדה לשמור על שלמות התא ודבקותו. בידוד גליה מעורבת מאזורי CNS מרובים מספק ניתוח מקיף של גליה הטרוגנית פוטנציאלית תוך מקסום השימוש בחיות ניסוי בודדות. בנוסף, לאחר דיסוציאציה של רקמה אזורית, גליה מעורבת מחולקת לסוגי תאים מרובים, כולל מיקרוגליה, OPCs ואסטרוציטים לשימוש בסוג תא בודד, בתוספות צלחת תרבית תאים או במערכות תרבית משותפת. בסך הכל, הטכניקות שהודגמו מספקות פרוטוקול מקיף של ישימות רחבה לניתוח זהיר של ארבעה אזורי CNS בודדים מילודים מורין וכוללות שיטות לבידוד של שלושה סוגי תאי גליה בודדים כדי לבחון הטרוגניות אזורית בכל מספר של מערכות תרביות תאים במבחנה או מבחנים.
גליה נחוצה לתפקוד עצבי תקין במערכת העצבים המרכזית. הם מורכבים משלוש תת-אוכלוסיות עיקריות, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה, שלכל אחד מהם תפקיד שונה, אך הכרחי1. ללא המגוון והפעילות התקינה של תאי גליה, תפקוד תאי העצב ייפגע קשות, מה שיוביל לפגיעה במערכת העצבים המרכזית. גליה מסוגלים להשפיע על העברה עצבית, וכל סוג תא עושה זאת באופן ייחודי. לתאי גליה במוח יש את היכולת לתקשר בינם לבין עצמם, כמו גם עם תאים עצביים, על מנת להקל על תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית2. אוליגודנדרוציטים מגבירים את מהירות ההעברה החשמלית באמצעות היווצרות נדן מיאלין, המאפשר את התקבצות תעלות היונים בצמתים של Ranvier, האתרים של פוטנציאל הפעולה העצבית דור3. מיקרוגליה הם קריטיים לגיזום של סינפסות על ידי ניטור העברה סינפטית ו”חיווט מחדש” של קשרים עצביים לאחר פציעה4. בנוסף, מיקרוגליה הם תאי החיסון המקומיים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית, הפועלים כצורה העיקרית של הגנה על המארח מפני פתוגנים5. אסטרוציטים יכולים לווסת את ההעברה הסינפטית בין נוירונים על ידי שינוי הריכוז של אשלגן חוץ תאי6. יש להם גם תפקידים בשליטה על זרימת הדם המקומית7, שחרור וקליטה של אלמנטים נוירומודולטוריים8, ויש להם תפקיד מפתח בתחזוקת מחסום דם-מוח9. לפיכך, כל תת-סוג גליה הוא קריטי לתפקוד מערכת העצבים המרכזית, שכן פגמים בכל סוג נקשרו זה מכבר למגוון רחב של מצבים פתולוגיים, כולל מחלות פסיכיאטריות, אפילפסיה ומצבים נוירודגנרטיביים10.
המכשול הגדול ביותר בחקר הפתוביולוגיה של מערכת העצבים המרכזית הוא חוסר היכולת לחקור תאים אנושיים בהקשר של הנישה המיקרו-סביבתית שלהם. רקמת הביופסיה האנושית נאספת ביותר לאחר המוות ותאים יכולים בקלות להינזק או ללכת לאיבוד במהלך המיצוי והעיבוד. יתר על כן, זהו אתגר לשמור על תאים אנושיים חיים וברי קיימא במבחנה לאורך זמן מבלי לגזור קווי תאים אימורטליים מגידולים, ואז הם כבר לא משקפים במדויק את התכונות הפיזיולוגיות הרגילות שלהם11,12. בנוסף, קיימת כמות משמעותית של הטרוגניות אזורית בקרב סוגי תאי גליהבודדים 13,14,15, והשגת דגימות CNS אזוריות מחולים בודדים היא כמעט בלתי אפשרית. ככזה, יש צורך לפתח מודלים חלופיים כדי לחקור את התרומה של גליה אזורית בהפרעות CNS ספציפיות.
כאן אנו מתארים מערכת חוץ גופית המשתמשת בבידוד ספציפי לאזור CNS של עכברים של תת-אוכלוסיות גליה מרובות, המאפשרת מניפולציה וכימות של מיקרוגליה, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים (OPCs), אשר מולידים אוליגודנדרוציטים בוגרים, ואסטרוציטים. כל אוכלוסייה יכולה להיות מבודדת באופן עצמאי ונתונה למגוון רחב של טכניקות ניסיוניות, כולל טיפול בתרופות או במולקולות, אימונוציטוכימיה, מיצוי וניתוח חלבונים/רנ”א ומערכות אחרות של תרביות משותפות בהתאם לצורך הניסויי. בנוסף, טכניקת בידוד זו מניבה מספר תאים גבוה, ומאפשרת אפיון וחקירה של כל אוכלוסיית גליות באופן בעל תפוקה גבוהה. הוא גם מאפשר לחקור התמיינות של תאי CNS, גדילה ושגשוג בתגובה למגוון רחב של גירויים מיקרו-סביבתיים באופן מבוקר על מנת למנוע גורמים מבלבלים אשר בדרך כלל נוכחים בסביבה in vivo. לבסוף, טכניקת בידוד תאים זו מאפשרת מניפולציה של אוכלוסיות תאי גליה בתוך אזורי CNS שונים כדי לחקור כיצד גליה אזורית מתקשרת זו עם זו ומגיבה לגירויים משתנים, מה שמאפשר דיוק ושכפול.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את הבידוד של שלוש תת-אוכלוסיות תאי הגליה העיקריות ממערכת העצבים המרכזית של העכבר: מיקרוגליה, OPCs ואסטרוציטים. מכשלה מרכזית בחקר מחלות CNS ניווניות ונוירו-דלקתיות היא היעדר תאים ורקמות אנושיים ראשוניים, במיוחד אלה שהם אזוריים ומאותו חולה. ברוב המקרים, קווי תאי CNS אנושיים נגזרים מתאים סרטניים שעברו טרנספורמציה ואימורטליזציה אשר עשויים שלא להיות ייצוגים מדויקים של התנהגותם הפיזיולוגית הרגילה20,21,22. לפיכך, יש צורך בשיטות חלופיות כדי לחקור פנוטיפים של תאי CNS באופן מבוקר. יתר על כן, המגוון של אוכלוסיות תאי גליה נוירולוגיים מחייב לחקור כל תת-סוג הן באופן בלתי תלוי זה בזה, והן בתנאי תרבית משותפת על מנת לשחזר הן את תפקודי התא האוטונומיים והן את תפקודיהם הלא אוטונומיים. לתאי גליה יש מגוון רחב של תפקודים קריטיים במערכת העצבים המרכזית, החל מתמיכה עצבית23, למידה/קוגניציה 24,25, ותגובות אימונולוגיות של מערכת העצבים המרכזית26. ככזה, יש צורך להבין את הפונקציות המולקולריות והתאיות של כל תת-אוכלוסייה גלית בהקשר פיזיולוגי ופתולוגי. על מנת לעשות זאת, אנו מספקים כאן שיטה אמינה למיצוי ובידוד של תת-סוגים בני קיימא של גליה. בשל אילוצים מעשיים ואתיים במחקרם של בני אדם, מודלים של בעלי חיים הם כיום הפונדקאים הרלוונטיים ביותר לביולוגיה של תאי גליה אנושיים. בפרט, עכברים הם חיות מודל אידיאליות מכיוון שניתן לתמרן ולנתח את הגנום שלהם כדי לנתח עוד יותר מנגנונים מולקולריים מסוימים העומדים בבסיס בריאות ומחלות. לכן, הסרה והפרדה מוצלחת של מיקרוגליה מורין, OPCs ואסטרוציטים היא כלי מפתח לחקר התפקודים של גליה במהלך מצבים פיזיולוגיים, נוירודגנרטיביים או נוירו-דלקתיים.
פרוטוקול זה יכול להיות ממוטב כדי לחקור הטרוגניות אזורית של תאי CNS. זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי glia להפגין הטרוגניות אזורית בצורה ובתפקוד. אסטרוציטים הם מגוונים אזורית ומציגים מורפולוגיה שונה בהתאם למיקומם בתוך CNS27. יתר על כן, צפיפות האסטרוציטים והאינדקס המיטוטי שלהם יכולים להגדיר אזורים אנטומיים, מה שתומך בהשערה שהטרוגניות של אסטרוציטים אזוריים עשויה לשקף הבדלים מולקולריים ותפקודיים בהתבסס על מיקומם בתוך CNS28. גם ההטרוגניות האזורית של מיקרוגליה נמצאת תחת חקירה פעילה, אם כי המנגנונים הבסיסיים וההשלכות התפקודיות של גיוון המיקרוגליה בפיתוח או בהתנהגות של CNS אינם ברורים בשלב זה. עם זאת, ידוע כי מיקרוגליה בוגרת מציגה גיוון במספר התא, במבנים התאיים והתת-תאיים, ובחתימות מולקולריות29. יתר על כן, ההתקדמות האחרונה בציטומטריה של מסה מרובבת הגדירה עוד יותר את ההטרוגניות האזורית של מיקרוגליה, תוך ניתוח פנוטיפ תאי מחמישה אזורי CNS שונים של תשעה תורמים אנושיים, מה שמאפשר אימונופנוטיפ בקנה מידה גדול של מיקרוגליה אנושית30. נכון לעכשיו, גישות כאלה נמצאות בשלבים המתהווים שלהן, מה שהופך את המחקרים בבעלי חיים לפתרון בר קיימא לחקר גליה אזורית בהתפתחות מחלות CNS. לבסוף, הטרוגניות אזורית תוארה לאחרונה גם באוליגודנדרוציטים. ריצוף RNA חד-תאי על 5072 תאים בודדים מ-10 אזורים של CNS צעירים ובוגרים זיהה 13 תת-אוכלוסיות שונות בשלבים שונים של התמיינות31. חשוב לציין כי ככל שהאוליגודנדרוציטים התבגרו מ-OPCs, פרופילי השעתוק שלהם התפצלו והפנוטיפים הפונקציונליים שלהם השתנו, מה שמדגיש את ההטרוגניות של אוליגודנדרוציטים בתוך CNS31.
לפיכך, הבנת ההטרוגניות האזורית של תאי CNS המתגוררים השונים בהקשר של תאי העצב השכנים המגוונים שלהם וגליה אחרת עשויה לספק רציונל חשוב לפיתוח עתידי של טיפולים חדשניים לטיפול בהפרעות נוירו-דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים. בעוד שפרוטוקול זה מתמקד במיצוי, בידוד וזיהוי של תת-אוכלוסיות גליות, הוא מספק נקודת התחלה נוחה לבחינת תפקידן. יתר על כן, ניתן להתאים אותו ולשלב אותו עם מודלים של עכברים מהונדסים על מנת לחקור מנגנונים גנטיים הקשורים לביולוגיה של תאי גליה. ניתן להשתמש בו גם כדי לבחון את התגובות של תאי גליה זה לזה במבחני תרבית משותפת. הצעדים המתוארים מייצגים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה של חילוץ ובידוד אוכלוסיות גליות CNS שונות, אשר לאחר מכן ניתן להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים. יש לציין; עם זאת, השיטה המתוארת כאן משתמשת בילודים בשל הרמות הנמוכות יותר של מיאלינציה וצפיפות גבוהה של גליה מתפשטת. מסיבות אלה, מבחינה טכנית ניתן יותר לבודד גליה בת קיימא מילודים בהשוואה לבעלי חיים בוגרים. לפיכך, יש לקחת בחשבון את ההבדלים הפנוטיפיים בגליה ילודים בהשוואה לגליה בוגרת במהלך תכנון הניסוי ופענוח הנתונים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למורגן פסניקה על העריכה והדיון בכתב היד ולד”ר גרהאם קיד על הסיוע בעיצוב הדמויות. עבודה זו נתמכה על ידי NIAID K22 AI125466 (JLW).
0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |