概要

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

Published: July 23, 2020
doi:

概要

Ex vivo脳スライスは、求心性入力に対する誘発反応に対する揮発性麻酔薬の効果を研究するために使用できます。光遺伝学は、視床皮質および皮質皮質求心性神経を非原発性新皮質に独立して活性化するために使用され、シナプスおよびネットワーク応答はイソフルランで調節されます。

Abstract

麻酔薬は、視床皮質回路に対する作用を介して意識に部分的に影響を及ぼします。しかし、揮発性麻酔薬がこれらの回路の明確な細胞およびネットワークコンポーネントにどの程度影響を与えるかは不明のままです。生体外脳スライスは、研究者が複雑なネットワークの個別のコンポーネントを調査し、誘発された反応に対する揮発性麻酔薬の影響の根底にある潜在的なメカニズムを解きほぐす手段を提供します。脳スライス中の潜在的な細胞タイプおよび経路特異的薬物効果を分離するには、研究者は求心性線維経路を独立して活性化し、重複しない細胞集団を特定し、揮発性麻酔薬を水溶液中の組織に適用できなければなりません。このプロトコルでは、ex vivo脳スライスにおける新皮質への2つの独立した求心性経路に対する光遺伝学的に誘発された応答を測定する方法が記載されている。細胞外応答はアッセイネットワーク活性に対して記録され、標的全細胞パッチクランプ記録はソマトスタチンおよびパルブアルブミン陽性介在ニューロンで行われます。細胞およびネットワーク応答を調節するための人工脳脊髄液を介した生理学的に関連する濃度のイソフルランの送達が記載されている。

Introduction

揮発性麻酔薬は、1世紀以上にわたってさまざまな臨床および学術環境で遍在的に使用されてきました。異なるクラスの麻酔薬は、独特の、しばしば重複しない分子標的1,2,3を持っていますが、それらのほとんどすべてが無意識を生み出します。それらの行動効果は非常に予測可能ですが、麻酔薬が意識喪失を誘発するメカニズムはほとんど知られていません。麻酔薬は、皮質視床回路上の作用を介して意識のレベルと内容の両方に最終的に影響を及ぼし、皮質階層全体の情報の統合を混乱させる可能性があります4,5,6,7,8,9。より広義には、コルチコ視床回路の調節は、実験的に10または薬理学的に11の変化した意識状態において役割を果たす可能性があり、睡眠12および意識の病態生理学的障害13,14にも関与し得る。

麻酔中の意識の喪失と回復の根底にあるメカニズムのとらえどころのないことは、細胞、ネットワーク、およびシステムレベルでの麻酔薬の非線形の相乗作用に部分的に起因する可能性があります15。イソフルランは、例えば、選択された脳領域16、17、18内の活動を抑制し、遠隔脳領域19、2021、22、23間の接続性を損ない、経路特異的な様式でシナプス応答を減少させる2425.分子レベルからシステムレベルまで、麻酔薬のどの効果が意識喪失をもたらすために必要または十分であるかは不明である。非侵襲的技術を用いた意識の実質的な臨床調査19,20,26に加えて、実験家が意識的経験に従属する明確な細胞およびネットワークの相互作用を解きほぐそうとすることが重要です。

無傷の脳に見られる複雑な相互作用を単純化することにより、ex vivo脳スライスは、脳の動的システムの孤立した構成要素の研究を可能にします9。縮小スライス調製は、局所神経回路の比較的無傷の解剖学的構造の利点とin vitro操作の多様性を兼ね備えています。しかし、最近まで、方法論的制約により、脳スライスにおける長距離入力のシナプスおよび回路特性の研究が妨げられていました27,28。コルチコ視床線維路の曲がりくねった経路は、電気刺激によって独立した求心性経路の活性化をほとんど不可能にしました。

脳スライス製剤に対する麻酔薬の効果を調査することは、さらなる課題を提示する。無傷の呼吸器系および循環器系がない場合、麻酔薬を入浴させ、濃度を推定効果部位の濃度に注意深く一致させる必要があります。.多くの静脈内麻酔薬にとって、組織内の平衡化速度が遅いため、従来の薬理学的調査は面倒です29,30。ex vivo製剤中の揮発性ガス麻酔薬の効果を調査することは、より扱いやすいですが、課題もあります。これらには、吸入分圧用量を水性濃度に変換すること、および人工脳脊髄液31を介した組織への薬物の修正送達システムの必要性が含まれる。

ここでは、研究者が揮発性麻酔薬イソフルランの十分に文書化された物理化学的特性を利用して、ex vivo脳スライスへの薬物送達を行い、高い時空間分解能で皮質領域への経路および層特異的入力を活性化し、同時に実施する方法について説明します 層流記録と標的パッチクランプ記録 ニューロンの選択された集団から。これらの手順を組み合わせることで、研究者は、シナプスレベルからローカルネットワークレベルまで、いくつかの観察可能な電気生理学的応答特性における揮発性麻酔薬誘発性の変化を測定できます。

Protocol

このプロトコルに記載されている動物を含むすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン医学部および公衆衛生動物管理および使用委員会によって承認されました。 1. 介在ニューロン亜集団で蛍光レポータータンパク質を発現させるマウスの繁殖 ホモ接合性のCre依存性tdTomato雄マウスを、ホモ接合型SOM-Cre雌マウスまたはホモ接合型PV-Cre雌マウスのいずれかと…

Representative Results

プロトコルで説明されている手順のタイムラインを 図 1 に示します。高次皮質領域または非一次視床核から到着する皮質入力は、非一次視覚野24の層1で部分的に重複する終末野を有する。独立した視床皮質または皮質皮質求心性経路を単離するために、ChR2およびeYFP蛍光レポーターを含むウイルスベクターをPoまたはCgのいずれかに注入した。注射半径…

Discussion

この原稿では、ex vivo脳スライスにおいて選択的に活性化された求心性経路に対する細胞内および細胞外の応答を評価するためのプロトコルが記載されている。

光遺伝学的ツールと並列記録スキームの使用により、研究者は、遠隔脳領域からの求心性入力に対する局所集団の応答を調査し、同時に介在ニューロンの標的集団から記録することができます。光遺伝学的技術?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、このプロジェクトに関する技術サポートとガイダンスを提供してくれたBryan Krauseに感謝します。

この研究は、国際麻酔研究学会(IMRAからAR)、国立衛生研究所(R01 GM109086からMIB)、およびウィスコンシン大学マディソン校の医学部および公衆衛生学部麻酔科の支援を受けました。

Materials

2.5x broadfield objective lens Olympus MPLFLN2.5X
40x water immersion objective lens Olympus LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 mixture Airgas Z02OX95R2003045
A16 probe NeuroNexus A16x1-2mm-100-177-A16 16-channel probe
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
Anesthetic gas monitor (POET II) Criticare 602-3A
ATP, Magnesium Salt Sigma Aldrich A9187 intracellular solution
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Laboratory 007914 Cre-dependent tdTomato mouse
B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J The Jackson Laboratory 008069 PV-Cre mouse
Belly Dancer Shaker Thomas Scientific 1210H86-TS for equilibration of sealed gas bags
Betadine solution Generic brand
Bleach Generic brand for silver chloriding patch clamp electrode
Bupivicaine
Calcium Chloride (CaCl2) Dot Scientific DSC20010 ACSF
Capillary glass (patch clamp recordings) King Precision Glass, Inc. KG-33 Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm
Capillary glass (viral injections) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X 3.5"
Control of junior micromanipulator Luigs and Neumann SM8 for control of junior micromanipulator
Control of manipulators and shifting table Luigs and Neumann SM7 for control of multichannel electrode and shifting table
Digidata 1440A + Clampex 10 Molecular Devices 1440A Digitizer and software
E-3603 tubing Fisher Scientific 14171208 for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping
EGTA Dot Scientific DSE57060 intracellular solution
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel Neuralynx Retired
Filling needle World Precision Instruments 50821912 for filling patch clamp pipettes
Filter cube for imaging EYFP Olympus U-MRFPHQ
Filter paper Fisher Scientific 09801E lay over slice template during preparation of tissue block
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument P-1000 2.5×2.5 Box filament
Gas dispersion tube Sigma Aldrich CLS3953312C
Glass syringe (100 mL) Sigma Aldrich Z314390 for filling gas-sealed bags
Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) Dot Scientific DSG37020 intracellular solution
Glucose Dot Scientific DSG32040 ACSF
GTP, Sodium Salt Sigma Aldrich G8877 intracellular solution
Headstage-probe adaptor NeuroNexus A16-OM16 adaptor to connect 16-channel probe to headstage input
Hemostatic Forceps VWR International 76192-096
HEPES Dot Scientific DSH75030 ACSF,intracellular solution
HS-16 Headstage Neuralynx Retired
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Isopropyl alcohol (70%) VWR International 101223-746
Junior micromanipulator Luigs and Neumann 210-100 000 0090-R for manipulation of patch clamp electrode
LED Light Source Control Module Mightex BLS-PL02_US optogenetic light source control
Lidocaine
Lynx-8 Amplifier Neuralynx Retired
Lynx-8 Power Supply Neuralynx Retired
Magnesium Sulfate (MgSO4) Dot Scientific DSM24300 ACSF
mCherry, Texas Red filter cube Chroma 49008 for imaging tdTomato fluorescent reporter
Meloxicam
Micropipette holder Fisher Scientific NC9044962
Microsyringe pump World Precision Instruments UMP3-4
Mineral oil Generic brand
MultiClamp 700A Molecular Devices/Axon Instruments 700A Amplifier
Nitrogen (for air table) Airgas NI200
Nylon mesh Fisher Scientific 501460083 stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings
Nylon, cut from pantyhose Generic brand small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp
Ophthalmic ointment Fisher Scientific NC1697520
Pipette Dot Scientific 307 For transferring tissue to rig
Platinum wire VWR International BT124000 2 cm, flattened, to make platinum harp
Polygon400 Mightex DSI-E-0470-0617-000 optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software
Potassium Chloride (KCl) Dot Scientific DSP41000 ACSF
Potassium Phosphate (KH2PO4) Dot Scientific DSP41200 ACSF
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Sapphire blade (for vibratome) VWR International 100492-502
Scalpel blade Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-361445
Sealed gas bag Fisher Scientific 109236
Shifting table for microscope Luigs and Neumann 380FMU
Sodium Bicarbonate (HCO3-) Dot Scientific DSS22060 ACSF
Sodium Chloride (NaCl) Dot Scientific DSS23020 ACSF, intracellular solution
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) The Jackson Laboratory 013044 SOM-Cre mouse
Stereotaxic instrument Kopf Model 902 Dual Small Animal
Super glue Staples 886833 to fix tissue block to specimen stage during slice preparation
Surgical drill RAM Products Inc. DIGITALMICROTORQUE Microtorque II
Syringe (1 mL) with LuerLock tip Fisher Scientific 309628 for application of pressure during patch clamping
Syringe (1 mL) with slip tip WW Grainger, Inc. 19G384 for filling patch clamp pipettes
Syringe Filters VWR International 66064-414
Upright microscope Olympus BX51
Vibrating microtome Leica Biosystems VT1000S
Wypall towels Fisher Scientific 19-042-427

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記事を引用
Murphy, C. A., Raz, A., Grady, S. M., Banks, M. I. Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics. J. Vis. Exp. (161), e61333, doi:10.3791/61333 (2020).

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