概要

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Published: September 27, 2020
doi:

概要

Cet article décrit l’isolement et la culture des neurones sympathiques embryonnaires de rat des ganglions cervicals supérieurs. Il fournit également des protocoles détaillés pour la coloration immunocytochimique et pour préparer des extraits neuronaux pour l’analyse spectrométrique de masse.

Abstract

Des neurones sympathiques des ganglions cervicals supérieurs de rat embryonnaire (SCG) ont été employés comme système de modèle in vitro pour les neurones périphériques pour étudier la croissance axonale, le trafic axonal, la synaptogenèse, la croissance dendritique, la plasticité dendritique et les interactions nerveuses-cibles dans les systèmes de co-culture. Ce protocole décrit l’isolement et la dissociation des neurones des ganglions cervicals supérieurs des embryons de rat E21, suivis de la préparation et du maintien des cultures neuronales pures dans le milieu sans sérum. Puisque les neurones n’adhèrent pas au plastique non couché, les neurones seront cultivés sur des couvercles en verre de 12 mm ou des plaques de 6 puits recouvertes de poly-D-lysine. Après un traitement avec un agent antimitotique (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), ce protocole génère des cultures neuronales saines avec moins de 5% de cellules non neuronales, qui peuvent être maintenues pendant plus d’un mois in vitro. Bien que les neurones embryonnaires de SCG de rat soient multipolaires avec 5-8 dendrites in vivo ; dans des conditions sans sérum, ces neurones ne s’étendent qu’à un seul axone en culture et continuent d’être unipolaires pendant toute la durée de la culture. Cependant, ces neurones peuvent être induits pour étendre les dendrites en présence de l’extrait de membrane de sous-sol, des protéines morphogenétiques d’os (BMP), ou 10% sérum foetal de veau. Ces cultures neuronales homogènes peuvent être utilisées pour la coloration immunocytochimique et pour les études biochimiques. Cet article décrit également le protocole optimisé pour la coloration immunocytochimique pour la protéine-2 associée aux microtubules (MAP-2) dans ces neurones et pour la préparation d’extraits neuronaux pour la spectrométrie de masse.

Introduction

Les neurones sympathiques dérivés des ganglions cervicals supérieurs embryonnaires (SCG) ont été largement utilisés comme système de culture neuronale primaire pour étudier de nombreux aspects du développement neuronal, y compris la dépendance aux facteurs de croissance, interactions neurone-cible, signalisation neurotransmetteur, croissance axonale, développement de dendrite et plasticité, synaptogenèse et mécanismes de signalisation sous-jacents nerf-cible/ neurone-glia interactions1,2,3,4,5,6,7,8,9. Malgré leur petite taille (environ 10000 neurones /ganglions), il ya trois raisons principales pour le développement et l’utilisation extensive de ce système de culture sont i) étant les premiers ganglions dans la chaîne sympathique, ils sont plus grands, et donc plus facile à isoler, que le reste des ganglions sympathiques10; ii) contrairement aux neurones centraux, les neurones de la SCG sont assez homogènes avec tous les neurones dérivés de la crête neuronale, ayant une taille similaire, la dépendance au facteur de croissance nerveuse et d’être nor-adrenergic. Cela en fait un modèle précieux pour les études morphologiques et génomiques10,,11 et iii) ces neurones peuvent être maintenus dans un milieu défini sans sérum contenant un facteur de croissance nerveuse pendant plus d’un mois10,12. Les neurones perinatal SCG ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’initiation et à l’entretien des dendrites2. C’est principalement parce que, bien que les neurones SCG ont une arborescence dendritique étendue in vivo, ils n’étendent pas les dendrites in vitro en l’absence de sérum, mais peuvent être induits à cultiver des dendrites en présence de certains facteurs de croissance tels que les protéines morphogenétiques osseuses2,12,13.

Cet article décrit le protocole pour isoler et cultiver les neurones embryonnaires de SCG de rat. Au cours des 50 dernières années, les cultures neuronales primaires du SCG ont été principalement utilisées pour des études morphologiques avec un nombre limité d’études examinant les changements génomiques ou protéomiques à grande échelle. Ceci est principalement dû à la petite taille des tissus ayant pour résultat l’isolement de faibles quantités d’ADN ou de protéines, ce qui rend difficile d’effectuer des analyses génomiques et protéomiques sur ces neurones. Cependant, ces dernières années, une sensibilité accrue à la détection a permis le développement de méthodes d’examen du génome, du miRNome et du protéome dans les neurones SCG pendant le développement de la croissance dendritique14,15,16,17. Cet article décrira également la méthode d’analyse morphologique de ces neurones à l’aide de l’immunocytochimie et d’un protocole pour obtenir des extraits de protéines neuronales pour l’analyse spectrométrique de masse.

Protocol

Toutes les procédures effectuées dans des études portant sur des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Saint Mary’s College of California. Les lignes directrices sur les soins et l’utilisation des animaux du Collège Saint Mary’s ont été élaborées sur la base des lignes directrices fournies par le Bureau du bien-être animal de laboratoire de l’Institut national de la santé (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimal…

Representative Results

Isoler et maintenir les cultures neuronales des neurones embryonnaires scgLes cellules dissociées du RAT embryonnaire SCG ont été plaquées dans une plaque enduite de poly-D-lysine ou coverslip et maintenues dans les milieux de culture sans sérum contenant le facteur de croissance de b-nerf. Les cellules dissociées contenant un mélange de neurones et de cellules gliales regardent circulaire sur le placage (Figure 1A). Dans les 24 heures suivant le placage, les neur…

Discussion

Cet article décrit les protocoles pour cultiver des neurones sympathiques des ganglions cervical supérieurs des chiots embryonnaires de rat. Les avantages de l’utilisation de ce système modèle sont qu’il est possible d’obtenir une population homogène de neurones fournissant une réponse similaire aux facteurs de croissance, et puisque les exigences de facteur de croissance pour ces neurones a été bien caractérisé, il est possible de cultiver ces neurones in vitro dans des médias définis, dans des conditi…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été appuyés par le Fonds de développement de la faculté et la subvention du Programme de recherche d’été du Saint Mary’s College of California. Les auteurs tiennent également à remercier la Dre Pamela Lein de l’Université de Californie à Davis et le Dr Anthony Iavarone de l’UC Berkeley Mass spectrometry facility pour leurs conseils lors de l’élaboration de ces protocoles. Les auteurs tiennent également à remercier Haley Nelson au Bureau des communications collégiales du Saint Mary’s College of California pour son aide à la production vidéo et au montage vidéo.

Materials

2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips – 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid – Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

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記事を引用
Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

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