הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

הטרנספורט האקסונלי של neurofilaments הוכח לראשונה בשנות ה-70 על ידי תיוג דופק רדיואיזוטופי¹. גישה זו הניבה שפע של מידע על תחבורה neurofilament ב vivo, אבל יש לו רזולוציה מרחבית וזמנית נמוכה יחסית, בדרך כלל על סדר של מילימטרים וימים במקרה^{הטוב 2}. יתר על כן, תיוג דופק רדיואיזוטופי היא גישה עקיפה הדורשת הזרקה והקרבה של בעלי חיים מרובים כדי ליצור קורס זמן יחיד. עם הגילוי של חלבוני פלורסנט והתקדמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשנות ה-90, לאחר מכן זה הפך להיות אפשרי לתעבורת neurofilament תמונה ישירות נוירונים תרבותיים בקנה מידה של שניות או דקות עם רזולוציה מרחבית תת מיקרומטר, מתן תובנה הרבה יותר גדולה לתוך מנגנון^{תנועה 3}. מחקרים אלה גילו כי פולימרים neurofilament באקסונים לנוע במהירות לסירוגין הן anterograde ו לאחור כיוונים לאורך מסלולים microtubule, מונע על ידי חלבונים מוטוריים microtubule. עם זאת, neurofilaments הם מבנים מוגבלים iffraction רק 10 ננומטר קוטר כי הם בדרך כלל רווחים מלבד שכניהם על ידי עשרות ננומטר בלבד; לכן, הפולימרים ניתן לעקוב רק נוירונים תרבותיים המכילים neurofilaments מופץ דלילה, כך פולימרים נעים ניתן לפתור משכניהם⁴. לכן, זה לא אפשרי כיום לעקוב אחר neurofilaments יחיד באקסונים המכילים פולימרים neurofilament בשפע, כגון אקסונים מילינציה.

כדי לנתח את התחבורה האקסונלית של neurofilaments באקסונים עשירים neurofilament באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנטית, אנו משתמשים בשיטת פלומת פעולה פלואורסצנטית שפיתחנו כדי ללמוד את התנהגות השהיה לטווח ארוך של neurofilaments^{בתאי עצב מתואורים 4,,5}. Neurofilaments מתויג עם חלבון היתוך נוירופילמנט פלואורסצנטי פוטואקטיבי מופעלים בקטע קצר של axon, ולאחר מכן קצב היציאה של נטים אלה מהאזור הפעיל הוא מכמת על ידי מדידת ריקבון פלואורסצנטי לאורך זמן. היתרון של גישה זו הוא שזה ניתוח ברמת האוכלוסייה של תחבורה neurofilament שניתן להחיל על זמן בקנה מידה של דקות או שעות ללא צורך לעקוב אחר התנועה של פולימרים neurofilament בודדים. לדוגמה, השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח את הקינטיקה של תעבורת neurofilament בתרבויות מדליה⁶.

לאחרונה, תיארנו את הפיתוח של עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא רמות נמוכות של חלבון neurofilament מתויג paGFP M (paGFP-NFM) בנוירונים תחת שליטתו של הנוירון האנושי ספציפי Thy1^{מקדם 7}. עכבר זה מאפשר ניתוח של תחבורת neurofilament בסיטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ. במאמר זה, אנו מתארים את הגישות הניסיוניות לניתוח תעבורת neurofilament באקסונים מיאליים של עצבי טיביים מעכברים אלה באמצעות שתי גישות. הראשונה של גישות אלה היא שיטת הבריחה הדופק המתואר לעיל. שיטה זו יכולה ליצור מידע על התנהגות ההשהיה של neurofilaments, אבל הוא עיוור לכיוון שבו הנינים לעזוב את האזור מופעל, ולכן אינו מאפשר מדידה של כיווניות נטו ומהירות^{תחבורה 8}. השנייה של גישות אלה היא שיטת התפשטות פולסים חדשה שבה אנו מנתחים לא רק את אובדן הפלואורסצנטי מהאזור הפעיל, אלא גם את העלייה ארעית בפלואורסצנטיות בשני חלונות איגוף שדרכה נעים הניאורים הפלואורסצנטיים כשהם יוצאים מהאזור הפעיל הן בכיוון אנטרולוגי והן בכיוון הנסיגה. בשתי הגישות, ניתן להשיג פרמטרים של תעבורת נוירופילמנט כגון המהירות הממוצעת, כיווניות נטו והתנהגות השהיה באמצעות ניתוח מתמטי ומידול של השינויים בפלואורסצנטיות בחלונות המדידה. איור 3 ממחיש את שתי הגישות הללו.

פרוטוקול זה מדגים את הניתוח וההכנה של העצב, ההפעלה וההדמיה של הפלואורסצנטיות paGFP, וכמת של תעבורת neurofilament מהתמונות שנרכשו באמצעות חבילת ההפצה FIJI של ImageJ⁹. אנו משתמשים בעצב הטיבי כי הוא ארוך (כמה ס”מ) ואינו מסתעף; עם זאת, באופן עקרוני כל עצב המביע paGFP-NFM מתאים לשימוש עם טכניקה זו אם ניתן לנתח אותו de-נדן מבלי לפגוע האקסונים.