以自动化和标准化方式制造基于水凝胶的3D培养模型的开源技术平台

注：该协议首先介绍 （1） 软件和 （2） 硬件设置，以使用户熟悉所需的安装和工作站。在关于（3）材料制备和（4）协议设计器应用程序的使用，（5）移液模块的校准和（6）自动协议的执行的部分之后，将详细强调。最后，描述了（7）验证和验证程序，包括吸光度读数和数据分析。 图 1 显示了包含各个任务的常规协议工作流。 1. 软件设置 注：本节包括安装应用程序编程接口（API）以及所需的协议设计器应用程序和校准终端的详细说明。以下说明是为树莓派（RPi）单板计算机编写的;但是，Windows 8，10和macOS 10.13 +也已成功与API和应用程序一起使用。 设置计算机环境。注意：熟悉 Python39 的基础知识、如何设置和使用 Raspberry Pi40、41 以及如何连接到 Internet42。以下教程步骤重点介绍特定于协议的步骤，有关 Raspberry Pi 用法的其他信息可在线获取40。 从任务栏或应用程序菜单中打开终端窗口。 更新系统的软件包列表：sudo apt-get update 升级所有已安装的软件包：sudo apt-get dist-upgrade 重新启动树莓派：sudo reboot 检查已安装的 Python 版本：python3 –version确保至少安装了Python 3.5;如果没有，请安装最新版本43。 安装 python pip，它使用 Python Package Index44 发布 Python 包：sudo apt-get install python3-pip 安装依赖项：pip install numpypip install python-resize-image注意：如果您使用的是Windows，则需要通过以下方式安装Windows-curses软件包：python -m pip install windows-curses 安装应用程序编程接口 （API）。注意：该 API 提供了一个简单的 Python 框架，旨在编写实验性协议脚本并操作工作站。成功执行生成的协议代码需要以下两个 API。 安装工作站 API：pip install openworkstation 安装 Opentrons API 以操作移液模块：pip install opentrons==2.5.2 验证 API 是否已成功安装：python3>>>导入开放工作站>>>导入 opentrons注意：API 和协议设计应用程序的大小分别为 2.2 MB 和 1.2 MB。在磁盘空间有限 （200 MB） 的情况下使用时，安装过程中未遇到任何问题。但是，磁盘空间要求取决于操作系统。 选择文件下载目录（校准终端、协议设计应用程序等）。注意：之后可以将文件复制并粘贴到其他位置。 从 GitHub 存储库克隆文件：git clone https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation注意：”git clone”命令克隆并随后将所有文件保存到该目录中，该目录此时在终端中打开。由于存储库还包括程序集的硬件文件，因此执行所提供的协议不需要整个存储库。复制实验所需的所有文件都可作为 补充文件 提供，并可在 GitHub 存储库中的”/examples/publication-JoVE”下找到。 打开下载的文件夹。如果整个存储库已下载，请通过以下方式导航到”publish-JoVE”文件夹cd openworkstation/examples/publication-JoVE注：此文件夹包括工作站操作以及使用协议设计器应用程序和校准终端所需的文件。 2. 硬件设置 将工作站放在生物安全柜中，以避免样品污染。 在工作站上安装移液器。 根据实验设置选择移液器尺寸。通常，取一个移液器尺寸，其吸气量在范围的较高端。如果特定设置需要体积大于 1 mL 的混合任务（例如，吸出/分液 2 mL），请选择最大吸出量/分液量为 1，000 μL 的 M1000E，以最大限度地减少移液步骤并节省时间。注：有关置换式移液器的详细说明，请在线获取45。开发的移液模块能够集成以下现成的正置换式移液器：M10E （1–10 μL）、M25E （3–25 μL）、M50E （20–50 μL）、M100E （10–100 μL）、M250E （50–250 μL）、M1000E （100–1，000 μL）。 使用 M4 内六角扳手松开并拧紧螺钉。 将两个移液器固定板（白色丙烯酸板）连接到铝制导轨上，然后松松地拧紧M5螺钉。 将移液器插入两个移液器固定板，并确保移液器的符合人体工程学的尾部位于丙烯酸安装板的另一侧。 拧紧两个移液器固定板的四个螺钉。 将连接到亚克力安装板上的两个方形紧固螺母滑入 z 轴的挤出槽中，然后拧紧螺钉。注：请紧紧固移液器，以避免在操作过程中有任何移动。 3. 材料准备 注意：粘性材料（甘油，GelMA，海藻酸盐）用于本研究中提出的实验，因此，制备的体积和处理任务（例如，在5 mL反应管中加入5mL储备溶液）专门用于此实验设置。 明胶甲基丙烯酰（GelMA）注意：GelMA功能化，透析和冻干不是本文的范围，并且在Loessner等人中提供了分步方案。该协议开始使用冻干凝胶MA，其可以在内部制备或商业购买。 使用以下公式，根据所需的最终储液浓度 （cGelMA） 和体积 （VGelMA） 计算所需质量的 GelMA （mGelMA）：mGelMA = cGelMA x VGelMA注意：VGelMA取决于实验设置，建议准备20-30%的过量材料。所提出的方案从5 mL 20%（w / v）GelMA作为储备溶液开始。 称取所需量的冻干凝胶MA，将其加入50 mL反应管中，并加入所需量的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。 通过将凝胶MA浸泡在4°C的溶剂中过夜或在水浴中加热至60°C6小时来混合GelMA。注意：无菌凝胶MA溶液可以在4°C的避光保护下储存至少六个月。 将 5 mL GelMA 灌装到 5 mL 反应管中。 光引发剂：苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂（LAP）注：避免过度暴露于室内光线下，因为 LAP 对光敏感。 使用以下公式，根据所需的最终库存浓度 （cLAP） 和所需体积 （VLAP） 计算所需 LAP （mLAP） 质量：mLAP = cLAP x VLAP注意：建议准备3%（w / v）的储备溶液。 称量所需量的LAP，将其加入15 mL反应管中并加入PBS。 将管子包裹在铝箔中以防止光致分解。 通过将反应管置于37°C的水浴中2小时或直到完全溶解来溶解LAP。 将 1 mL LAP 储备溶液倒入 5 mL 管中。 海藻 酸 使用以下公式根据所需的最终库存浓度（甘膦酸盐）和体积（醛酸盐）计算所需的海藻酸盐（麦氏酸盐）量：麦氏酸盐 = 甘氨酸盐 x 甘酸盐酸盐注意：戊酸盐取决于实验设置，建议准备20-30%的过量材料。所提出的方案从5 mL的4%（w / v）海藻酸盐作为储备溶液开始。 称量所需质量的海藻酸盐，将其加入50 mL反应管中，然后加入PBS。 将海藻酸盐混合物放入37°C的水浴中4小时。注意：使用涡流混合器将加速溶解过程，但也会产生气泡。溶解的海藻酸盐可以在4°C下储存至少六个月。 将 5 mL 海藻酸盐倒入 5 mL 反应管中。 将 5 mL 甘油倒入 5 mL 反应管中。 橙色G溶液 在50 mL反应管中制备10mg / mL橙色G储备溶液。注意：数量取决于实验次数。根据稀释剂类型，在超纯水，PBS或合适的稀释剂试剂中制备储备溶液。在所提出的实验中，使用超纯水稀释甘油，使用PBS稀释GelMA和海藻酸盐。PBS被用作GelMA和海藻酸盐的稀释剂，可以使用片剂制备或现成购买。 通过涡旋混合10秒。 将管子包裹在铝箔中以防止光致分解。注意：储备溶液可以在24小时后使用，以确保Orange G的适当溶解。 将储备溶液稀释至50 mL反应管中的1mg / mL工作溶液。 将工作溶液转移到适当的烧瓶/管中以进行实验设置。注意：对于所提出的实验，将工作溶液填充到5 mL管中。橙G储备和工作溶液可以储存在4°C，并在制备后三个月内使用。 将 5 mL 1 mg/mL 橙色 G 工作液倒入 5 mL 反应管中。 4. 使用协议设计器应用程序生成协议代码 注：步骤4.2−4.7中指定的参数对于所有进行的实验都是相同的，但材料的库存浓度和最终输出浓度除外。这些参数总结在 表1 中，在下文中，参数用于制备具有5%（w / v）GelMA，2%（w / v）海藻酸盐，0.15%（w / v）LAP和PBS作为稀释剂的双网络水凝胶。 通过运行”ProtocolDesignApp.html”打开协议设计器应用程序。注意：应用程序”ProtocolDesignApp.html”将指导用户完成参数选择过程，并自动生成即用型协议来操作工作站。用户界面运行在每个常用的互联网浏览器（即Chrome，Firefox，Safari，edge，Internet Explorer）上。 在设置页面上输入协议名称（例如，双网络水凝胶）。 单击”继续”以确认协议名称并继续执行下一步。 通过从下拉菜单中选择”3×4 加热块”和以下输入参数来定义输入托盘： 从下拉菜单中选择”凝胶1″，输入名称”GelMA”，输入库存浓度”20%”，将”样品数量”设置为”3″以填充一列。单击”+添加”以保存条目。 从下拉菜单中选择”凝胶2″，输入名称：”海藻酸盐”，输入库存浓度”4%”，将”样品数量”设置为”3″以填充一列。单击”+添加”以保存条目。 从下拉菜单中选择”光引发剂”，输入名称：”LAP”，输入库存浓度”3%”，将”样品数量”设置为”3″以填充一列。单击”+添加”以保存条目。 从下拉菜单中选择”稀释剂1″，输入名称：”PBS”，将”样品数量”设置为”3″以填充一列。单击”+添加”以保存条目。注：单击”+add”后，输入托盘的可视化会自动更新。如果添加的输入数超过托盘的容量，则会向用户显示警告”此托盘的样本太多”。 通过选中”照片交联”并输入时间（以秒为单位）、”30″和强度 W/m2 并输入”2″来定义交联参数。 通过单击”继续”完成输入设置。 通过在孔板类型的下拉菜单中选择”96 孔板”来定义输出托盘设置。 单击”Group1″，通过创建一组样本来定义输出。 通过在每个输入的字段中输入所需的浓度和样品体积来指定输出成分：GelMA = ‘5’，海藻酸盐= ‘2’，LAP = ‘0.15’，总体积= ’60’。 复选框以应用高级混合协议。 通过在”样本数”字段中输入样本数来指定样本数：”96″。注：单击”+添加组”后，样品盘的可视化会自动更新。如果添加的样品超过托盘的容量，则会向用户显示警告”此托盘的样品太多”。 通过单击”继续”完成输出设置。 在甲板布局上选择托盘位置并相应地准备平台： 选中”插槽A1″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Empty_Cell”。 选中”插槽A2″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Trash_Cell”。 选中”插槽 B1″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Tips_Cell_100 μL”。 选中”插槽 B2″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Tips_Cell_1000 μL”。 选中”插槽C1″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Input_Cell”。 选中”插槽 C2″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Empty_Cell”。 选中”插槽D1″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Mixing_Cell”。 选中”插槽D2″字段中的复选标记，然后从下拉菜单中选择”Output_Cell”。 通过选中”左移液器”，从下拉菜单中选择”10-100μL正置换量”并将吸气速度设置为”600″，分配速度= “800”，定义第一个移液器（M100E）的类型和特性。 通过选中”移液器正确”，从下拉菜单中选择”100-1000μL正置换量”并将吸气速度设置为”800″，分配速度= “1200”，定义第二移液器（M1000E）的类型和特性。 单击”生成协议”以确认设置并生成协议脚本。注意：每当生成新协议时，开发的协议设计器应用程序都会自动生成一个新文件夹。此实验和操作工作站所需的所有文件都保存在此文件夹中，该文件夹以协议名称命名。可以将该文件夹复制到不同的目录中，而不会引起问题。 不要关闭接口，因为它将用于执行协议（请参阅步骤 6.6）。 5. 移液模块的校准 注意：容器（例如，孔板、吸头架、垃圾桶）和移液器（例如 M1000E）必须首先进行校准。如果容器和/或移液器位置被修改/更改，则必须校准新位置。 导航到协议文件夹，并通过在终端 windox 中执行文件”calibrate.py”打开校准终端（参见步骤 1.1.1）：phython.calibrate.py注：”calibrate.py”界面可指导用户完成台式设置和移液器的校准。确保该文件与协议文件和模块文件位于同一文件夹中。它是在步骤 4.10 中自动生成的。 使用数字键盘 （1−8） 选择柱塞、y、z 移动的移动增量：”1″表示 0.1 mm，”2″表示 0.5 mm，”3″ 表示 1 mm，”4″ 表示 5 mm，”5″ 表示 10，”6″ 表示 20 mm，”7″ 表示 40 mm，”8″ 表示 80 mm。 校准移液器。 按键盘快捷键 P 选择移液器尺寸。 按键盘快捷键 V 进入柱塞校准模式。注：建议从小增量（2、5 和 10 mm）开始，以熟悉移液器头的增量大小和运动动作。 校准容积式移液器的以下柱塞位置：T–Top = 静止位置;B–底部 = 柱塞被推动，直到遇到阻力;P–拾取 = 柱塞被推到可以连接活塞尖端的位置;E–弹出 = 柱塞被推动，直到连接的尖端被弹出。使用键盘上的向上和向下箭头改变柱塞位置，并使用键盘上的 S 保存最终位置。 按键盘快捷键 V 离开移液器柱塞校准模式。 校准容器相对于移液器吸头的位置。 按键盘快捷键 P 选择移液器类型。确保吸头已连接到选定的移液器。 按键盘快捷键 C 选择容器类型。 选择适当的移动增量，并将移液器吸头移动到以下位置。对于孔板，校准到底部的”A1″孔位置;对于吸头架，校准到”A1″位置;对于回收站，请选择一个位置（定义为一个点），以便将吸头弹出到垃圾箱中。 按键盘快捷键 S 保存位置。 对所选移液器类型在”C”下列出的所有容器重复步骤5.3.1−5.3.3。 对第二种移液器类型重复5.3.1−5.3.5。 关闭校准脚本。 6. 使用工作站执行协议 注意：协议文件可通过存储库访问，也可以作为 补充文件提供。 将垃圾箱、吸头架、进纸盘、混合盘和出料放在料台上（在步骤 4.3 中定义）。 校准第 5 节中定义的移液器和仪器。 如果需要，请打开温度底座，并选择输入和混合托盘的温度。注意：本教程中的实验在没有温度控制的情况下进行，甘油在40°C下进行，GelMA和海藻酸盐移液在37°C下进行。 根据所选设置，将带有输入试剂的管子定位在温度底座上的铝块中。 等到输入试剂达到所需温度。注意：为确保适当的温度分布，建议凝胶MA和海藻酸盐的孵育时间为30分钟。 通过单击”运行PYTHON脚本”执行协议文件注意：选定的协议现在由工作站执行。随附的视频重点介绍了GelMA的自动混合以及将60μL分配到96孔板中。 当显示”已完成”时，运行完成。 7. 验证和验证过程 从工作站上取出孔板，并将孔板与样品一起运送到分光光度计。 使用分光光度计读取450nm处的吸光度。读取每个板2x以比较结果并确保结果一致。 导出并保存吸光度读数。 数据分析。注意：实验数据可以单独处理，也可以复制并粘贴到提供的模板中，以使用电子表格软件评估平均值，标准差和方差系数（CV）值。 打开 补充文件 “supplementary_template分析.xlsx”，该文件也可以在GitHub存储库中的”openworkstation/examples/publication-JoVE”下使用。 将吸光度读数复制到”原始数据”表中，确保所有表中正确定义所有细胞参考，然后单击”分析”表以获取有关平均值，标准偏差和方差系数（CV）值的信息。注意：根据孔板上的样品分布，模板提供以下预设评估类型：当所有样品具有相同的成分时使用”均匀”类型，当不同行中的样品具有不同的成分时使用”按行”类型，当不同色谱柱中的样品具有不同的成分时使用”按列”类型， 当样品位置是用户特定的时，将使用”自定义”类型。