В Vivo Ориентация нейронных клеток-предшественников в Ferret Neocortex от In Utero Electroporation

Неокортекс является внешним листом головного мозга млекопитающих и местом высших^{когнитивных функций 1,,2,,3,,4,,5.} Для достижения острой генетической манипуляции в млекопитающих neocortex in vivo во время эмбрионального развития, были изучены два различных метода: вирусная^{инфекция 6} и в утробе матери электропорации⁷. Оба метода позволяют эффективной ориентации неокортикальные клетки, но страдают от некоторых ограничений. Основным преимуществом в электропорации матки по сравнению с вирусной инфекцией является способность достичь пространственной специфичности в неокортексе, которая достигается путем регулирования направления электрического поля.

Так как электропорация была впервые показана для облегчения вступления^{ДНК в клетки}in vitro 8 , она была применена для доставки ДНК в различных позвоночных in vivo. В развитии неврологии, в утробе матери электропорации мыши неокортекс был впервые зарегистрирован в 2001^{году 9,10}. Этот метод состоит из инъекции смеси ДНК в боковой желудочек эмбрионального мозга и последующего применения электрического поля с использованием пинцетовых электродов, что позволяет^{пространственную точность 7,,11}. В утробе электропорации с тех пор были применены для доставки нуклеиновых кислот для того, чтобы манипулировать экспрессией эндогенных или эктопически добавленных генов в неокортексе мыши. Важный прогресс был достигнут в последнее время, применяя методологию CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома через в утробе матери электропорации в неокортексе мыши для выполнения (1) генного нарушения^{в постмитотических нейронах 12,,13} и нейронных^{клетках-предшественниках 14}, и (2)^{геном 15} и эпигеноме¹⁶ редактирования.

Очень скоро после первого сообщения в мыши, в утробе электропорации был применен к эмбриональной крысы neocortex^17,18. Не-грызунов остается проблемой до первого в утробе матери электропорации хорьков, небольшой хищник, было сообщено в 2012^{году 19,20}. С тех пор в утробе матери электропорация хорьков была применена для изучения механизмов развития неокортекса путем маркировки нейронных прародителей^{и нейронов 20,,21,,22,23}, манипулируя экспрессией эндогенных генов, в том числе с использованием технологии CRISPR/Cas9²⁴, и путем доставки эктопических генов^21,,22,,25,в том числе^{человеческих генов 26.} Кроме того, в утробе матери электропорация хорьков была использована для решения особенностей развития неокортекса человека в^{патологических условиях 27,28}.

В контексте развития неокортекса преимущества использования хорьков в качестве образцового организма по сравнению с мышами обусловлены тем, что хорьки лучше резюмируют ряд человеческих особенностей. На анатомическом уровне хорьки демонстрируют характерный узор коркового складывания, который также присутствует у человека и большинства других приматов, но полностью отсутствует у^{мышей или крыс 4,,29,,30,,31.} На гистологическом уровне хорьки имеют две различные субвентрикулярные гермезинальные зоны, называемые внутренними и внешними субвентрикулярными зонами (ISV и OSV, соответственно)^32,33, разделенные слоем^{внутреннего волокна 23.} Эти функции также совместно с приматами, в том числе людей, но не с^{мышами 34}. ISV и OSV у хорьков и людей населены обильными нейронными клетками-предшественниками, в то время как субвентрикулярная зона (СВЗ) мышей содержит только редкие нейронные прародители^21,32,35,36. На клеточном уровне хорьки обладают высокой долей подтипа нейронных прародителей, называемых базальной или внешней радиальной глией (bRG или oRG, соответственно), которые считаются инструментальными для эволюционного расширения неокортекса^{млекопитающих 34,37,38.} bRG, следовательно, весьма обильные в плода человека и эмбрионального неокортекса хорька, но они очень редки в эмбриональной мыши neocortex^35,36. Кроме того, хорек bRG показывает морфологическую неоднородность, похожую на человеческую bRG, намного превосходя мышь bRG²¹. Наконец, на молекулярном уровне, развивающихся хорька неокортекс показывает модели экспрессии генов очень похожи на плода человека неокортекса, которые, как предполагается, контролировать развитие корковых складывания, среди^{прочего 39}.

Клеточные биологические и молекулярные характеристики хорька bRG делают их высокоо распространения, похожие на человека bRG. Это приводит к увеличению производства нейронов и развитию расширенного и очень сложного неокортекса^34. Эти характеристики делают хорьков отличными модельными организмами для изучения человеческих особенностей развития неокортекса, которые не могут быть смоделированы^{у мышей 26,,40.} Чтобы в полной мере использовать хорька в качестве образцового организма, был разработан представленный метод. Он состоит из в утробе матери электропорации эмбрионов хорька E33 с плазмидной экспрессии GFP (pGFP) под контролем вездесущего промоутера, CAG. Электропомерные эмбрионы могут быть проанализированы эмбрионально или постнатально. Для того, чтобы уменьшить количество принесенных в жертву животных, самки хорьков (джиллс) стерилизованы гистерэктомией и пожертвованы для усыновления в качестве домашних животных. Если целевые эмбрионы собирают на эмбриональных стадиях, проводится вторая операция и эмбрионы удаляются кесаревой сечением, в то время как джиллы гистерэктомизируются. Если целевые эмбрионы анализируются на послеродовой стадии, джиллс гистерэктомизированы после того, как щенки были отутены или принесены в жертву. Таким образом, протокол для гистерэктомии jills также представлен.