Изучение влияния сигаретного дыма на инфекцию Псевдомонас в эпителиальных клетках легких
概要
Описано здесь протокол для изучения того, как экстракт сигаретного дыма влияет на бактериальную колонизацию эпителиальных клеток легких.
Abstract
Курение сигарет является основной этиологической причиной эмфиземы легких и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Курение сигарет также способствует восприимчивости к бактериальным инфекциям в дыхательной системе. Тем не менее, влияние курения сигарет на бактериальные инфекции в клетках эпителия легких человека до сих пор тщательно не изучены. Описано здесь подробный протокол для подготовки экстрактов курения сигарет (CSE), лечение эпителиальных клеток легких человека с CSE, и бактериальной инфекции и определения инфекции. CSE был подготовлен обычным методом. Легкие эпителиальные клетки лечились с 4% CSE для 3 ч. CSE-обработанные клетки были, то, инфицированных Pseudomonas при множественности инфекции (MOI) 10. Бактериальные нагрузки клеток определялись тремя различными методами. Результаты показали, что CSE увеличила нагрузку Pseudomonas в легких эпителиальных клеток. Таким образом, этот протокол обеспечивает простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.
Introduction
Курение сигарет влияет на здоровье населения миллионов людей во всем мире. Многие вредные заболевания, в том числе рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), как сообщается, связаныс курением сигарет 1,2. Курение сигарет повышает восприимчивость к острым микробным инфекциям в дыхательной системе3,,4,,5. Кроме того, растущие доказательства доказывают, что курение сигарет усиливает патогенез многих хронических расстройств6,,7,,8. Например, курение сигарет может увеличить вирусные или бактериальные инфекции, которые вызывают обострение ХОБЛ9. Среди бактериальных патогенов, которые этиологически способствуют острому обострению ХОБЛ, оппортунистический грамотрицатель бактерий патоген, Pseudomonas aeruginosa, вызывает инфекции, которые коррелируют с плохими прогнозами и более высокойсмертности 10,11. Обострение ХОБЛ ухудшает болезнь за счет ускорения патологического прогрессирования. Нет эффективных методов лечения обострения ХОБЛ, за исключением антисимптомного управления12. Обострение ХОБЛ способствует смертности пациентов, снижает качество жизни и увеличивает экономическую нагрузку на общество13.
Дыхательные пути представляют если вылазаемые дыхательные пути, то есть открытые системы, постоянно подвергаемые различным микробным патогенам, присутствующим за пределами страны. Оппортунистические бактериальные патогены обычно обнаруживаются в верхних дыхательных путях, но иногда наблюдаются в нижнихдыхательных путях 14,,15. В животных моделях P. aeruginosa могут быть обнаружены в альвеолярных мешках уже через 1 ч после заражения16. Как основной защитный механизм, иммунные клетки, такие как макрофаги или нейтрофилов устранить бактерии в дыхательных путях. Эпителиальные клетки легких, как первый физиологический барьер, выполняют уникальную роль в защите хозяина от микробных инфекций. Легкие эпителиальные клетки могут регулировать микробное вторжение, колонизацию или репликацию независимо от иммунных клеток17. Некоторые молекулы, найденные в эпителиальных клетках, включая PPARg, оказывают антибактериальные функции, тем самым регулируя бактериальную колонизацию и репликацию в эпителиальных клеткахлегких 18. Курение сигарет может изменить молекулы и ухудшить нормальную функцию защиты в легких эпителиальныхклеток 19,20. Недавние исследования сообщили о прямом воздействии сигаретного дыма на легочные эпителиальные клетки с помощьюробота курительного аппарата 21,22. Воздействие дыма может быть выполнено другими способами, однако, в том числе применение CSE. Подготовка CSE является воспроизводимым подходом с потенциальным применением в других типах клеток, включая сосудистые эндотелиальные клетки, которые косвенно подвергаются воздействию сигаретного дыма.
В этом докладе описывается протокол для создания экстракта сигаретного дыма для изменения бактериальной нагрузки в клетках эпителия легких. CSE увеличивает бактериальную нагрузку P. aeruginosa, и это может способствовать рецидиву бактериальных инфекций, как правило, наблюдается при обострении ХОБЛ. Для подготовки CSE используется обычный метод. Легкие эпителиальные клетки, на их экспоненциальной стадии роста, лечатся с 4% CSE для 3 ч. Кроме того, монослойные эпителиальные клетки легких могут быть непосредственно подвержены воздействию сигаретного дыма в воздухо-жидком интерфейсе. CSE-обработанные клетки после этого оспорены с Pseudomonas на разносторонности инфекции (MOI) 10. Бактерии распространяются с определенной скоростью встряхивания, чтобы обеспечить морфологию их flagella остается нетронутым, чтобы сохранить их полную инвазивную способность. Гентамицин используется для уничтожения бактерий, оставшихся в среде культуры, тем самым уменьшая потенциальное загрязнение во время последующего определения бактериальной нагрузки. Протокол также использует GFP помечены Pseudomonas, который был использован в качестве мощного инструмента в изучении инфекции Pseudomonas в различных моделях. Репрезентативным штаммом является P. fluorescens Migula23. Степень инфекции или бактериальной нагрузки после лечения CSE определяется тремя способами: метод drop plate с подсчетом колоний, количественный ПЦР с использованием Pseudomonas 16S rRNA-специфических грунтовок, или цитометрия потока в клетках, инфицированных флуоресцентными Pseudomonas. Этот протокол представляет можно простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бактериальное вторжение в легочные эпителиальные клетки является важным шагом в патогенеза бактериальных инфекций. Процесс бактериального вторжения в клетки может быть разбит на следующие три шага: во-первых, бактерии контакт и придерживаться поверхности эпителиальной клетки, испол…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения R01 гранты HL125435 и HL142997 (к СЗ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
参考文献
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
