여기에 설명된 담배 연기 추출물이 폐 상피 세포의 세균 성 식민지화에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 프로토콜이 있습니다.
담배 흡연은 폐 기종및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 주요 병인원인입니다. 담배 흡연은 또한 호흡기내 세균 감염에 대한 감수성을 촉진합니다. 그러나, 인간의 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기가 나는 의 효력은 아직 철저히 공부되지 않았습니다. 여기에 설명된 담배 흡연 추출물(CSE), CSE를 함유한 인간 폐 상피 세포의 치료, 세균 감염 및 감염 결정의 준비를 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. CSE는 종래의 방법으로 제조하였다. 폐 상피 세포는 CSE 처리된 세포가 3h. CSE 처리된 세포에 대해 4% CSE로 처리된 다음, 10의 감염(MOI)의 복합성에서 슈도모나스로 감염되었다. 세포의 세균적 하중은 세 가지 다른 방법에 의해 결정되었다. 결과는 CSE가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 부하를 증가했다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 프로토콜은 폐 상피 세포의 세균 감염에 대한 담배 연기의 영향을 연구하기 위한 간단하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.
담배 흡연은 전 세계 수백만 명의 공중 보건에 영향을 미칩니다. 폐암및 만성폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 많은 해로운 질환은 담배 흡연1,2와2관련이 있는 것으로 보고된다. 담배 흡연은 호흡기33, 4,4,5에서급성 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 더욱이, 장착 증거는 담배 흡연이 많은 만성 질환의 발병을 향상시킨다는 것을 증명6,,7,,8. 예를 들어, 담배 흡연은 COPD 악화를 일으키는 바이러스성 또는 세균성 감염을 증가시킬 수 있습니다9. 에인디컬쳐가 COPD의 급성 악화에 에 기여하는 세균성 병원체 들 중, 기회성 그람 음성 혈관 병원균, 슈도모나스 아루기노사,가난한 예후 및 더 높은 사망과 상관 관계가 있는 감염을 일으킨다10,,11. COPD 악화는 병리학적 진행을 가속화하여 질병을 악화시다. 항증상 관리를 제외하고는 COPD 악화에 대한 효과적인 치료법이없다(12). COPD 악화는 환자 사망률을 촉진하고 삶의 질을 감소시키고 사회13에대한 경제적 부담을 증가시킵니다.
호흡기기도는 개방된 시스템으로, 지속적으로 외부적으로 존재하는 다양한 미생물 병원균을 받는다. 기회성 세균성 병원균은 일반적으로 상부 기도에서 검출되지만 때로는 하부기도(14,,15)에서관찰된다. 동물 모델P. aeruginosa감염 후 1h로 즉시 폐포 낭에서 검출될 수 있다16. 주요 방어 메커니즘으로, 대식세포 또는 호중구와 같은 면역 세포는 기도에 있는 박테리아를 제거합니다. 폐 상피 세포는 첫 번째 생리 장벽으로서 미생물 감염에 대한 숙주 방어에서 독특한 역할을 수행합니다. 폐 상피 세포는 면역세포(17)와무관한 미생물 침입, 식민지 화 또는 복제를 조절할 수 있다. PPARg를 포함한 상피 세포에서 발견되는 일부 분자는 항균 기능을 발휘하여 폐 상피세포(18)에서세균 성 식민지화 및 복제를 조절한다. 담배 흡연은 분자를 변경하고 폐 상피 세포(19,,20)에서정상적인 방어 기능을 손상시킬 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 로봇 흡연장치(21,,22)를사용하여 폐 상피 세포에 담배 연기가 직접 노출되었다고 보고하였다. 연기에 노출은 CSE의 적용을 포함하여 다른 방법으로 수행될 수 있습니다. CSE의 준비는 담배 연기에 간접적으로 드러나는 혈관 내피 세포를 포함하여 그밖 세포 모형에 있는 잠재적인 응용을 가진 재현가능한 접근입니다.
이 보고서는 폐 상피 세포에 있는 세균성 부하를 바꾸기 위하여 담배 연기 추출물을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. CSE는 P. aeruginosa의세균성 부하를 증가시키고, 일반적으로 COPD 악화에서 볼 수있는 세균 감염의 재발에 기여할 수 있습니다. 종래의 방법은 CSE의 제조를 위해 사용된다. 폐 상피 세포는 기하급수적인 성장 단계에서 3 시간 동안 4 % CSE로 치료됩니다. 대안적으로, 단층 배양폐 상피 세포는 공기 액체 인터페이스에서 담배 연기에 직접 노출될 수 있다. CSE 처리된 세포는 그 때 10의 감염 (MOI)의 복합성에 슈도모나스와 도전됩니다. 박테리아는 그들의 전체 침략적인 용량을 유지하기 위하여 그들의 flagella의 형태가 그대로 남아 있는지 확인하기 위하여 특정 동요 속도로 전파됩니다. 겐타마이신은 배양 배지에 남아 있는 박테리아를 죽이기 위해 사용되며, 이에 따라 세균 부하의 후속 결정 시 잠재적 오염을 감소시킵니다. 이 프로토콜은 또한 다른 모델에서 슈도모나스 감염을 연구하는 강력한 도구로 활용된 GFP 라벨 슈도모나스(Pseudomonas)를사용합니다. Pseudomonas 대표적인 균주는 P. 형광의미굴라(23)이다. Migula23 CSE 치료 후 감염 또는 세균 부하의 정도는 콜로니 카운팅을 이용한 드롭 플레이트 방법, 슈도모나스 16S rRNA 특이프라이머를 이용한 정량적 PCR 또는 형광 슈도모나스에감염된 세포종계의 유동 세포측정등 세 가지 방법으로 결정된다. 이 프로토콜은 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기의 효력을 연구하기 위하여 간단하고 재현가능한 접근입니다.
폐 상피 세포로 세균성 침입은 세균 감염의 병인에 있는 결정적인 단계입니다. 세포내 세균 성 침입 과정은 다음 세 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 박테리아접촉및 그들의 기색 세포를 사용하여 상피 세포의 표면에 부착. 둘째, 박테리아는 내산화를 거치거나 세포막을 관통한다. 마지막으로, 박테리아는 세포 방어 메커니즘25,,26을성공적으로 탈출하?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강 R01의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었다 HL125435 및 HL142997 (CZ에).
50mL syringe | BD Biosciences | ||
airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
Cell Counter | Bio-Rad | ||
CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
OD reader | USA Scientific | ||
PCR primers | ITD | ||
Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |