생쥐의 폐쇄 흉부 카테터 삽입에 의한 심장 기능 및 압력-부피 루프의 양심실 평가

모든 실험은 Queen’s University 생물안전 및 윤리 지침(ROMEO/TRAQ#6016826)에 따라 수행되었습니다. 다음 절차는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 이것은 터미널 절차입니다. 좌우 카테터 삽입의 침습성으로 인해 동물은 데이터 수집 후 즉시 안락사시켜야 합니다. 안락사는 해당 기관의 동물 연구 지침에 따라 수행되어야 합니다. 1. 실험 준비 및 설정 실험을 시작하기 30분 전에 실온에서 식염수/헤파린이 포함된 10mL 주사기에 카테터를 넣습니다(그림 1A). 30분 후 제조업체의 권장 사항에 따라 카테터(예: 기준선 및 획득 시스템)를 보정합니다. 수집 시스템은 실험을 시작하기 전에 수집 시스템을 보정하는 데 사용되는 높은 교정 값과 낮은 교정 값을 표시합니다. 이러한 값을 출력하고 일치하는지 확인합니다.”압력 균형 제어”, “거친 +/- ” 또는 “미세 +/-” 버튼을 사용하여 기준 압력 값을 0으로 설정합니다. 높은 신호와 낮은 신호에 대해 2점 보정을 수행합니다.제어 콘솔의 “카테터 메뉴”에서 “시스템 설정”을 누릅니다. “시스템 설정 메뉴”에서 “보정 신호 보내기”를 눌러 낮은 신호를 보냅니다. 압력, 부피, 위상 및 크기가 각각 0mm Hg, 0μL, 0° 및 0μs인지 확인합니다. “Enter”를 눌러 높은 신호를 보냅니다. 압력, 부피, 위상 및 크기가 각각 100mmHg, 150μL, 20° 및 5,000μs인지 확인합니다. “Enter”를 눌러 “시스템 설정 메뉴”로 돌아갑니다. “6”을 눌러 “카테터 메뉴”로 돌아갑니다. 그런 다음 “데이터 수집”을 누릅니다. 30G 바늘을 약 90°로 구부립니다(그림 1B,C). 이 구부러진 바늘은 경정맥과 경동맥을 뚫는 데 사용됩니다. 2. 마취 및 체온 조절 마우스(이 프로토콜의 경우 28g, C57BL/6)를 마취 가스(즉, 산소 100%, 유도용 이소플루란 3–4%)가 들어 있는 마취실에 넣습니다. 동물이 마취되었을 때 발이나 꼬리 꼬집음에 반응하지 않으면 37°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 누운 상태로 놓습니다. 100% 산소와 2%의 이소플루란을 혼합하여 노즈콘을 통해 마우스를 호흡기에 연결합니다. 권장 환기 설정을 자동으로 계산하려면 터치 스크린을 사용하여 인공 호흡기의 독점 소프트웨어에 동물의 체중을 입력합니다. 계산에는 다음 수식이 사용됩니다.일회 호흡량 = 6.2 x 동물 질량1.01 (kg),호흡수 = 53.5 x 동물 질량-0.26 (kg). 마취실에서 코뿔까지의 마취 라인을 켭니다. 온도 피드백 프로브를 직장에 삽입하고 패드와 마우스 뒷면 사이에 패드 프로브를 삽입하여 원하는 체온을 37°C–37.5°C로 설정합니다. 모니터 화면에서 동물의 체온을 제어합니다(그림 2A,B). 수술용 테이프를 사용하여 쥐의 앞발과 한쪽 말단 발을 가열 담요에 테이프로 붙이고 한쪽 뒷발을 자유롭게 남겨 두어 마취 깊이를 모니터링합니다. 3. 수술 부위 접근 흉골에서 설골 수준까지 2cm H자형 복부 정중선 경추 절개를 수행합니다.피부를 밑에 있는 근육에서 멀리 반사시킵니다. 필요한 경우 더 나은 시각화를 위해 이러한 근육을 절제할 수 있습니다. 턱밑샘을 옆으로 부드럽게 움직입니다. 자궁경부 연조직을 절개하고 흉쇄유돌근과 흉골설근을 겸자로 노출시켜 둔한 절제법으로 노출시킵니다. 중간에 근막을 쪼개고 쌍을 이루는 흉골 위에 놓습니다. 짝을 이룬 흉골설골이 옆으로 수축되어 기관을 노출시킵니다. 기관과 나란히 있는 경동맥과 미주신경이 손상되지 않도록 주의한다. 기관 아래에 집게를 통과시켜 기관을 들어 올립니다. 그런 다음 기관 아래에 4.0 수술용 실크 봉합사를 통과시키고 봉합사 중간에 잠재적인 매듭을 만들고 나중에 기관 내 튜브를 고정하기 위해 조입니다(그림 3A). 가위를 사용하여 후두 높이 아래의 기관 연골 고리 사이를 작게 자릅니다. 기관내 튜브를 삽입합니다(그림 3B). 기관절개관을 호흡기에 연결하고 100% 산소와 2% 이소플루란으로 인공호흡을 시작합니다. 기관 주위의 매듭을 조여 기관내 튜브를 고정하고 호흡기 튜브를 수술대에 테이프로 붙입니다. 기관이 막히거나 무너지지 않았는지 확인합니다(그림 3C). 4. 우경정맥 및 우경동맥 격리 우경동맥 격리둔기 박리를 사용하여 흉골 설근을 측면으로 변위시켜 오른쪽 경동맥을 노출시키고 격리합니다. 겸자를 사용하여 둔하게 절개하여 미주 신경에서 경동맥을 분리합니다. 미주 신경을 제외한 경동맥 아래에 3개의 수술용 봉합사(4.0)를 통과시킵니다. 우측 경정맥 격리턱밑샘과 이하선을 측면으로 변위시켜 오른쪽 경정맥을 시각화합니다. 겸자를 사용하여 오른쪽 경정맥을 무뚝뚝하게 절개하고 노출시킵니다. 정맥을 조심스럽게 해부하고 주변 근막을 제거합니다. 경정맥 아래에 겸자를 통과시킵니다. 경정맥 아래에 수술용 봉합사 하나를 통과시킨 다음 정맥의 두개골 쪽에 묶습니다. 지혈 클램프를 사용하여 머리 방향으로 이 봉합사에 부드러운 견인을 가합니다. 경정맥 아래에 두 개의 추가 봉합사를 통과시킵니다. 지혈 클램프를 사용하여 꼬리 방향으로 가장 원위 봉합사를 부드럽게 당깁니다. 중간 봉합사에 느슨한 잠재적 매듭을 만드십시오. 정맥 절제술이 예상되는 부위의 혈관에 따뜻하고 생리적인 식염수 몇 방울을 떨어뜨립니다. 5. 우심실 및 좌심실 카테터 삽입을 위한 수술 절차 우심실 카테터 삽입(그림 4 A–D).실체현미경을 사용하여 경정맥을 식별합니다. 정맥에 우수한 견인력을 부드럽게 가하십시오. 두개골 봉합사와 중간 봉합사 사이에 30G의 곡선 바늘을 삽입하여 정맥 절제술을 수행합니다. 바늘을 정맥에 대해 140° 각도로 삽입하여 동축 방식으로 들어가도록 합니다. 삽입 시 바늘을 움직여 정맥 절제술을 확장합니다. 카테터 팁을 정맥 절개술의 바늘 아래에 삽입합니다. 그런 다음 중간 봉합사를 부드럽게 묶어 카테터를 고정합니다.알림: 과도한 힘은 카테터를 손상시킬 수 있으므로 봉합사를 너무 세게 묶지 않도록 각별히 주의하십시오. 꼬리 봉합사를 풀고 카테터를 우심실로 전진시켜 연속 모니터에서 고전적인 우심실 압력 파형을 감지합니다. 우심실압을 안정시킵니다. 최적의 PV 루프를 생성하기 위해 우심실에 카테터가 올바르게 배치되었는지 확인하십시오.혈액과 근육을 반영하는 크기를 안정화하여 압력-크기 루프(즉, Y축 압력, X축 크기)를 생성합니다. 필요한 경우 카테터 샤프트를 부드럽게 돌려 우심실 축을 따라 카테터를 최적으로 배치합니다.알림: 근육을 반사하는 최대 위상 값은 7° 미만이어야 합니다. 압력-크기 루프 신호가 최적이면 수집 중에 콘솔에서 “Enter”를 눌러 베이스라인 스캔을 수행합니다. 모니터 화면에 보고된 분당 박동수(bpm)가 생리학적 범위(예: 400–600bpm)에 있는지 확인합니다. PV 루프를 생성합니다. X축의 매개변수로 “Magnitude”를 “Volume”으로 변경하고 압력을 Y축으로 유지합니다. PV 루프 신호가 최적일 때 30초 동안 녹음합니다. 녹음을 중지합니다. 카테터를 뒤로 당기고 거즈로 부드럽게 닦습니다. 카테터를 헤파린/염화나트륨 용액에 넣고 꼬리 봉합사를 묶어 경정맥에서 출혈을 멈춥니다. 좌심실 카테터 삽입(그림 5 A–D).이전에 동맥 아래로 구부러진 집게를 밀어 분리(5A)했던 오른쪽 경동맥을 부드럽게 들어 올립니다. 이전 봉합사를 묶어 동맥을 막습니다. 그런 다음 지혈 클램프를 사용하여 두개골 지향 견인을 부드럽게 적용합니다. 지혈 클램프를 사용하여 꼬리 방향으로 가장 원위 봉합사를 당깁니다. 중간 봉합사에 느슨한 잠재적 매듭을 만듭니다. 예상되는 동맥 절제술 부위의 혈관에 따뜻하고 생리적인 식염수 몇 방울을 떨어뜨립니다. 입체 현미경을 사용하여 꼬리와 중간 봉합사 사이의 두개골 부분에 초점을 맞춥니다. 동맥에 우수한 견인력을 부드럽게 가하십시오. 두개골 봉합사와 중간 봉합사 사이에 30G의 곡선 바늘을 삽입하여 동맥 절제술을 수행합니다. 바늘을 동맥에 대해 140°로 삽입하여 동축 방식으로 들어가도록 합니다. 카테터 팁을 동맥 절제술에 삽입한 다음 중간 봉합사를 조여 카테터를 고정합니다. 동시에 원위 봉합사를 해제하고 카테터를 대동맥으로 전진시켜 녹음을 시작합니다. 압력 채널이 일반적인 대동맥 흔적을 나타내는지 확인합니다. 카테터를 대동맥 판막을 가로질러 좌심실로 역행시킵니다. 좌심실로의 진입은 대동맥에서 이완기 압력이 갑자기 현저하게 떨어지는 것에서 분명해질 것입니다. 좌심실 압력을 안정시킵니다. 최적의 PV 루프를 생성하기 위해 좌심실에 카테터의 올바른 위치를 확인하십시오.혈액과 근육을 반영하는 크기를 안정화하여 압력-크기 루프(즉, Y축 압력, X축 크기)를 생성합니다. 필요한 경우 카테터 샤프트를 부드럽게 돌려 좌심실 축을 따라 카테터를 최적으로 배치합니다.알림: 근육을 반사하는 최대 위상 값은 7° 미만이어야 합니다. 녹음을 중지합니다. 카테터를 뒤로 당겨 헤파린/염화나트륨 용액에 넣습니다. 그런 다음 꼬리 봉합사를 묶습니다. 효소 세제(예: 엔도자임)로 카테터를 청소합니다.참고: 수술 후 해당 기관의 동물 연구 지침에 따라 동물을 안락사시킵니다.  6. 데이터 분석 설정된 권장 사항에 따라 PV 루프 분석을 수행합니다.최적의 압력-부피 트레이스를 선택합니다(이상적으로는 전체적이고 안정적인 30초 기록). 소프트웨어에서 “고급”을 클릭하고 “루프”를 클릭한 다음 “오프라인 계산”을 클릭합니다. 부피를 부피 채널로 선택하고 압력을 압력 채널로 선택합니다. 일관된 결과를 얻으려면 최소 20개의 루프가 필요합니다.