マウスにおける閉鎖胸腔カテーテル法による心機能および圧力容積ループの両心室評価

すべての実験は、クイーンズ大学のバイオセーフティおよび倫理ガイドライン(ROMEO/TRAQ#6016826)に従って実施されました。従った手順は、機関のガイドラインに従って行われました。これは端末プロシージャです。左右のカテーテル検査は侵襲性が高いため、データ取得後すぐに安楽死させる必要があります。 安楽死は、施設の動物実験ガイドラインに従って行う必要があります。 1. 実験の準備とセットアップ 実験開始の30分前に、生理食塩水/ヘパリンを含む10 mLシリンジにカテーテルを入れ、室温で30分間入れます(図1A)。 30分後、メーカーの推奨に従ってカテーテル(ベースラインや取得システムなど)を校正します。アクイジションシステムには、実験開始前にアクイジションシステムのキャリブレーションに使用される高いキャリブレーション値と低いキャリブレーション値が表示されます。これらの値を出力し、一致していることを確認します。「圧力バランス制御」、「粗い+/-」、または「細かい+/-」ボタンを使用して、ベースライン圧力値をゼロに設定します。 高信号と低信号の2点校正を実行します。コントロールコンソールで、「カテーテルメニュー」の「システム設定」を押します。 「システム設定メニュー」の「キャリブレーション信号の送信」を押して、ロー信号を送信します。圧力、容量、位相、マグニチュードがそれぞれ0 mm Hg、0 μL、0°、0 μsであることを確認します。 「Enter」を押してハイ信号を送信します。圧力、容量、位相、マグニチュードがそれぞれ100 mm Hg、150 μL、20°、5,000 μsであることを確認してください。 「Enter」を押して「システム設定メニュー」に戻ります。 「6」を押して「カテーテルメニュー」に戻ります。次に、「データを取得」を押します。 30 Gの針を約90°に曲げます(図1B、C)。この曲がった針は、頸動脈と頸動脈の血管に穴を開けるために使用されます。 2.麻酔と体温調節 マウス(28 g、本プロトコルではC57BL/6)を麻酔ガス(すなわち、酸素100%、誘導用イソフルラン3〜4%)を含む麻酔チャンバーに入れます。 動物が麻酔をかけられ、前足や尻尾をつまんでも反応しない場合は、37°Cに設定した加熱パッドの上にマウスを仰臥位に置きます。 100%の酸素と2%のイソフルランの混合物を提供するノーズコーンを介してマウスをマスクに接続します。推奨される換気設定を自動的に計算するには、タッチスクリーンを使用して動物の体重を人工呼吸器の専用ソフトウェアに入力します。計算には、次の式を使用します。一回換気量= 6.2 x動物質量1.01 (kg)、呼吸数= 53.5 x動物質量-0.26 (kg)。 麻酔室からノーズコーンまでの麻酔ラインをオンにします。 温度フィードバックプローブを直腸に挿入し、パッドプローブをパッドとマウスの背面の間に挿入し、希望の体温を37°C〜37.5°Cに設定します。 モニター画面で動物の体温を制御します(図2A、B)。 サージカルテープを使用して、マウスの前足と遠位片片を加熱ブランケットにテープで固定し、片方の後足を自由にして麻酔の深さを監視できるようにします。 3. 手術部位へのアクセス 下顎骨から舌骨の高さまで2cmのH字型の腹側正中線頸部切開を行います。下にある筋肉から皮膚を遠ざけます。必要に応じて、これらの筋肉を切除して視覚化を良くすることができます。 顎下腺をそっと脇に動かします。 頸部軟部組織を解剖し、鈍的解剖法を用いて鉗子で胸鎖乳突筋と胸骨舌骨筋を露出させます。 真ん中で筋膜を分割し、対になった胸骨舌骨を覆います。対になった胸骨舌骨筋を横方向に引っ込めて気管を露出させます。気管に沿って走る頸動脈や迷走神経を傷つけないように注意してください。 鉗子を気管の下に通して気管を持ち上げます。次に、4.0の外科用シルク縫合糸を気管の下に通し、縫合糸の中央に潜在的な結び目を作り、後で締めて気管内チューブを固定します(図3A)。 はさみを使用して、喉頭の高さより下の気管の軟骨リングの間に小さな切り込みを入れます。気管内チューブを挿入します(図3B)。 気管切開チューブを人工呼吸器に接続し、100%酸素と2%イソフルランで換気を開始します。気管の周りの結び目を締めて気管内チューブを固定し、人工呼吸器チューブを手術台にテープで固定します。気管が閉塞したり潰れたりしていないことを確認してください(図3C)。 4.右頸動脈と右頸動脈の分離 右頸動脈の分離鈍的解剖を使用して、胸骨舌骨筋を横方向に変位させ、右頸動脈を露出させて分離します。 鉗子を用いた鈍解剖により、迷走神経から頸動脈を分離する。 迷走神経を除く頸動脈の下に3本の外科的縫合糸(4.0)を通します。 右頸静脈隔離顎下腺と耳下腺を横方向に変位させて、右頸静脈を視覚化します。鉗子を使用して右頸静脈を鈍く解剖して露出させます。静脈を慎重に解剖し、周囲の筋膜を取り除きます。 頸静脈の下に鉗子を通します。 頸静脈の下に外科用縫合糸を1本通し、静脈の頭蓋側で結びます。止血クランプを使用して、この縫合糸に頭の方向に穏やかな牽引を加えます。 頸静脈の下にさらに2本の縫合糸を通します。止血クランプを使用して、最も遠位の縫合糸を尾方向にそっと引っ張ります。真ん中の縫合糸に緩い結び目を作ります。 温めた生理食塩水を数滴、血管切開部位の血管に置きます。 5. 右心室・左心室カテーテル法の外科的処置 右心室カテーテル法(図4 A–D)。実体顕微鏡を使用して、頸静脈を特定します。 静脈に優れた牽引力を優しく適用します。頭蓋縫合糸と中央縫合糸の間に30Gの湾曲した針を挿入して、静脈切開を行います。針を静脈に対して140°の角度で挿入し、同軸で入るようにします。 挿入したら、針を動かして静脈切開部を拡張します。カテーテルの先端を静脈切開室の針の下に挿入します。次に、真ん中の縫合糸を静かに結び、カテーテルを固定します。注意: 過度の力はカテーテルを損傷する可能性があるため、縫合糸をきつく結びすぎないように細心の注意を払ってください。 尾側縫合糸を解放し、カテーテルを右心室に進め、連続モニターで古典的な右心室圧波形を検出します。 右心室圧を安定させます。.カテーテルを右心室に正しく配置して、最適なPVループを生成します。血液と筋肉を反映するマグニチュードを安定させて、圧力とマグニチュードのループ(つまり、Y軸の圧力、X軸の大きさ)を生成します。必要に応じて、カテーテルシャフトを静かに回転させて、右心室の軸に沿ってカテーテルを最適に配置します。注意: 筋肉を反映する最大位相値は、7°未満である必要があります。 圧力-マグニチュードループ信号が最適な場合は、収集中にコンソールの「Enter」を押してベースラインスキャンを実行します。モニター画面に毎分拍数(bpm)で報告される心拍数が生理学的範囲(つまり、400〜600 bpm)にあることを確認します。 PV ループを生成します。X軸のパラメータとして「Magnitude」を「Volume」に変更し、圧力をY軸として維持します。PVループ信号が最適になったら、30秒間録音します。 記録を停止します。カテーテルを引き戻し、ガーゼでやさしく拭きます。カテーテルをヘパリン/塩化ナトリウム溶液に入れ、尾側縫合糸を結んで頸静脈からの出血を止めます。 左心室カテーテル検査(図5 A–D)。湾曲した鉗子を動脈の下にスライドさせることにより、以前に分離された右頸動脈(5A)を静かに持ち上げます。 前の縫合糸を結び、それによって動脈を閉塞します。次に、止血クランプを使用して頭蓋方向に牽引を静かに適用します。 止血クランプを使用して、最も遠位の縫合糸を尾方向に引っ張ります。真ん中の縫合糸に緩い結び目を作ります。 温めた生理食塩水を数滴、予想される動脈切開術の部位の血管に置きます。脳定位固定装置を使用して、尾側と中央縫合糸の間の頭蓋部分に焦点を合わせます。 動脈に優れた牽引力を優しく適用します。頭蓋縫合糸と中央縫合糸の間に30Gの湾曲した針を挿入して、動脈切開術を行います。針を動脈に対して140°で挿入し、同軸で入るようにします。 カテーテル先端を動脈切開術に挿入し、中央の縫合糸を締めてカテーテルを固定します。同時に、遠位縫合糸を解放し、カテーテルを大動脈に進めて記録を開始します。圧力チャネルが典型的な大動脈トレースを示していることを確認します。 カテーテルを大動脈弁を横切って左心室に逆行させます。左心室への侵入は、大動脈からの拡張期血圧の突然の著しい低下から明らかです。 左心室圧を安定させます。.左心室のカテーテルを正しく配置して、最適なPVループを生成します。血液と筋肉を反映するマグニチュードを安定させて、圧力とマグニチュードのループ(つまり、Y軸の圧力、X軸の大きさ)を生成します。必要に応じて、カテーテルシャフトを静かに回転させて、左心室の軸に沿ってカテーテルを最適に配置します。注意: 筋肉を反映する最大位相値は、7°未満である必要があります。 記録を停止します。カテーテルを引き戻し、ヘパリン/塩化ナトリウム溶液に入れます。次に、尾側縫合糸を結びます。 酵素界面活性剤(エンドジムなど)でカテーテルを洗浄します。注:手術後、施設の動物実験ガイドラインに従って動物を安楽死させてください。  6. データ解析 確立された推奨事項に従って PV ループ分析を実行します。最適な圧力-体積トレースを選択します(理想的には、完全に安定した30秒の記録)。ソフトウェアで、「アドバンス」をクリックし、「ループ」をクリックしてから、「オフライン計算」をクリックします。 ボリュームをボリュームチャネルとして選択し、圧力チャネルとして圧力を選択します。 一貫した結果を得るには、最低でも 20 回のループが必要です。