多能干细胞人类巨噬细胞的产生与表征

注：该协议中使用的所有试剂和设备都列在材料表中。细胞培养的介质应为37°C。差别化协议中使用的介质和试剂必须无菌。 1. 人类 iPSC 线路解冻和维护 制备电池维护介质、生长因子和其他试剂。 准备hESC-血清自由介质（hESC-SFM;见材料表），补充Dulbecco改进的鹰中F12（DMEM/F12）与hESC补充剂，1.8%v牛血清白蛋白（BSA），和0.1mM 2-甲帽乙醇。 ( 通过在无菌0.1%的人类血清白蛋白（HSA）-磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中溶解bFGF，制备人类基本成纤维细胞生长因子（bFGF）库存溶液（10 μg/mL）。将库存溶液作为 200 μL 等分值在低温管中分配。库存溶液可储存在 -20 °C，长达 1 年。解冻后，库存bFGF可在4°C下储存7天。 通过在无菌水中溶解，制备罗激酶抑制剂（ROCK抑制剂）-Y27632库存溶液（1mg/mL）。将库存溶液作为 50 μL 等分值在低温管中分配。库存溶液可储存在 -20 °C，长达 1 年。解冻后，库存ROCK抑制剂可在4°C下储存7天。 稀释干细胞基质（见材料表）1：50在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水与钙和镁。 将稀释的干细胞基板溶液放在培养板上，使每个表面积的最终体积为78μL/cm2。要覆盖 6 孔板的孔，添加 750 μL 溶液。 在37°C和5%CO2的嗡嗡气氛中孵育涂层板1小时。 吸附干细胞基质涂层，加入1 mL的hESC，辅以20纳克/mL bFGF和10μMROCK抑制剂。 解冻冷冻人类iPSC细胞小瓶，在37°C下孵育小瓶，直到解冻，并将细胞转移到5 mL hESC-SFM介质中。 离心细胞在100 x g下3分钟。 在 0.5 mL hESC-SFM 中重新悬浮，辅以 20 ng/mL bFGF 和 10 μM ROCK 抑制剂。将细胞转移到涂层井中。 培养24小时单元格。 将介质更改为 hESC-SFM，辅以 20 ng/mL bFGF，但没有 ROCK 抑制剂。 要维持细胞，每天更换介质，直到细胞达到80%的汇合度。未分化的iPSC通常需要3~4天才能达到80%的汇合率。 一旦细胞达到80%汇合，通道细胞。 用 1.5 mL 的新鲜 hESC-SFM 替换已用培养介质，并辅以 20 ng/mL bFGF（不含 ROCK 抑制剂）。 一只手握住培养容器，在一个方向（即从左到右）将一次性细胞传通工具（参见材料表）滚动在盘子上。滚轮中的所有刀片都必须接触板。滚动时保持均匀的压力。 重复在同一方向滚动，直到整个井被覆盖。 旋转培养容器 90°并重复滚动，如步骤 1.12.2 和 1.12.3 所述。 使用后丢弃通路工具。 使用无菌移液器，在井中使用介质来驱赶切割的菌落。 以1：4的比例将细胞转移到预涂层干细胞基底井（步骤1.2-1.5）到最终介质体积（hESC-SFM，辅以20纳克/mL bFGF）为每口1.5mL。 2. 人类 iPSC 线路冻结 要冷冻 iPSC 细胞，请将 6 孔板的 70%-80% 汇结孔的介质替换为 hESC-SFM，并辅以 20 纳克/mL bFGF 和 10 μM ROCK 抑制剂。 在37°C和5%CO2下孵好1小时。 使用细胞传通工具切割菌落，并将分离的菌落放入离心管中。 离心细胞在100 x g下3分钟。 吸气介质，并在1 mL的细胞低温保存介质中重新悬浮细胞（参见材料表）。 将细胞平均分成两个低温，并在4°C下将它们放入预冷冻细胞冷冻容器中。 将细胞储存在-80°C，温度为24~48小时。 将小瓶转移到 -135 °C 冰柜或液氮罐。 3. 人类iPSC分化为巨噬细胞 注：图1中描述了巨噬字体区分协议的原理图摘要。 制备细胞分化生长因子和其他试剂 准备 hESC-SFM 介质（请参阅上一节）。 通过将明胶溶解成无菌水中，制备0.1%的乳胶溶液。明胶溶液可在4°C下储存长达2年。 通过将 BMP4 溶解成 4 mM 氯化氢 （HCl）-0.2% BSA PBS 溶液，制备人类 BMP4 库存溶液 （25 μg/mL）。将库存溶液作为 50 μL 等分值在低温管中分配。库存溶液可储存在 -20 °C，长达 1 年。解冻后，库存 BMP4 可在 4°C 下储存 5 天。 通过将 VEGF 溶解成 0.2% BSA PBS 溶液，制备人类 VEGF 库存解决方案 （100 μg/mL）。将库存溶液作为 10 μL 等分液在低温管中分配。库存溶液可储存在 -20 °C，长达 1 年。解冻后，VEGF库存可在4°C下储存7天。 通过将 SCF 溶解成 0.2% BSA PBS 溶液，制备人类 SCF 库存解决方案 （100 μg/mL）。将库存溶液作为 5 μL 等分液在低温管中分配。库存溶液可储存在 -20 °C，长达 1 年。解冻后，库存SCF可在4°C下储存10天。 通过将 IL3 溶解成 0.2% 的 BSA PBS 溶液，制备人类 IL3 库存溶液 （10 μg/mL）。将库存溶液作为 500 μL 等分值在低温管中分配。库存溶液可储存在-20°C，长达2年。解冻后，库存SCF可在4°C下储存15天。 通过将 CSF1 溶解成 0.2% 的 BSA PBS 解决方案，制备人类 CSF1 库存溶液 （10 μg/mL）。将库存溶液作为 1 mL 等分件在低温管中分配。库存溶液可储存在-20°C，长达2年。解冻后，库存SCF可在4°C下储存15天。 通过溶解成0.2%的BSA PBS溶液，制备干扰素伽马（IFNg）、白他素4（IL4）和白他素10（IL10）的单独10微克/mL库存溶液。通过溶解成 0.2% 的 BSA PBS 溶液，将脂多糖 （LPS） 准备到 100 U/mL 的库存溶液中。将每种库存溶液分配为 35 μL 等分。储存在-80°C，长达2年。解冻后，库存可在4°C下储存7天。 第1阶段：胚胎体生成（第0天-第3天） 第 0 天，将 2.25 mL 的 1 级介质（hESC-SFM 补充 50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF 和 20 ng/mL SCF）加入超低附件 6 孔板的两口井中。 用 1.5 mL 的 1 级 1 级介质在 6 孔板上更换 iPSC 一个 80% 的汇结孔的维护介质。 使用细胞传通工具切割菌落，并用移液器将切割菌落转移到超低附件6孔板的两口井中（参见材料表）。 第 2 天，使用 0.5 mL hESC-SFM 介质将细胞因子的最终浓度达到 50 纳克/mL BMP4、50 ng/mL VEGF 和 20 ng/mL SCF。注：IPSC殖民地将成为EB（图2A）。 第2阶段：悬架造血细胞的出现 第4天，涂4口6井组织培养板的0.1%v明胶，孵育至少10分钟。 去除明胶，加入2.5 mL的阶段2介质（X-VIVO15辅以100纳克/mL CSF1，25 ng/mL IL-3，2 mM谷胱甘肽，1%青霉素-链霉素，和0.055 mM 2-麦卡普托乙醇）。 将形成的EB收集到50mL离心管中，使其通过重力在管底沉降。小心地吸气媒体。 在 2 阶段介质的 2 mL 中重新挂起 EB。 将 10~15 个 EB（不超过 15 个）转移到含有 2.5 mL 第 2 级介质的明胶涂层井中。 在37°C和5%CO2空气中孵育EB。 每 3⁄4 天更换镀 USB 上的介质，持续 2⁄3 周。 2⁄3周后，EB 开始释放不粘质造血细胞进入悬浮液。注：此悬浮细胞释放期可能有所不同，并且取决于细胞线。悬浮液中的细胞可以收获并成熟成巨噬细胞（参见第3阶段）（图2A）。 第 3 阶段：终端巨噬体成熟 收集悬浮造血细胞，并在EB板上补充介质（第2级介质）。 离心悬浮电池在200 x g下3分钟。 第 3 级介质中重新悬浮细胞（X-VIVO15 辅以 100 ng/mL CSF1、2 mM 谷氨酸和 1% 青霉素链霉素）。 板收集细胞，并将细胞剥离到未经处理的10厘米细菌级板（10 mL）或未涂覆的6个井组织培养板（3 mL），密度为0.2 x 106细胞/mL。 将细胞保留在第 3 阶段介质中 9-11 天，每 5 天更换一次介质。注：第 3 阶段的步骤 3.4.1_3.4.5 可每 3⁄4 天重复一次，从原始 EB 板中收获的悬浮细胞长达 3 个月。 巨噬体极化 要激活M（LPS + IFNg）表型的巨噬细胞，用LPS（最终浓度：100纳克/mL）和IFNg（最终浓度：10 U/mL）刺激细胞48小时。要激活细胞到M（IL4）表型，用IL4刺激细胞（最终浓度：20纳克/mL）。要激活到 M（IL10） 表型，使用 IL10 刺激巨噬细胞（最终浓度：5 纳克/mL）。 4. iPSC 衍生的巨噬细胞质量控制检查 使用造血细胞计计数每6孔EBs中产生的造血悬浮细胞数量。 评估大噬菌体形态（例如，商业套件染色）8，,9. 使用基因表达分析和流细胞测定检测巨噬细胞特异性标记和偏振标记的表达，如前所述的8、99。 在6孔大噬细胞的一口井上进行流细胞测定实验，通过吸气其成熟介质来收获细胞，用2 mL的PBS清洗，并在室温（RT）下用2 mL的酶自由细胞分离缓冲液孵育5分钟。移液反复分离和收获巨噬细胞。 用造血计计数细胞，并在80μL中重新悬浮在2%BSA、0.5M乙烯二甲酸（EDTA）-PBS溶液中。 添加 20 μL 的 MACS 人 FC阻滞器。 在冰上孵育20分钟，防止光线照射。 加入适当体积为 2% BSA，0.5 mM EDTA PBS 溶液，使细胞浓度达到 1 x 106巨噬细胞/mL。 在 100 μL 中染色 1 x 105细胞，2% BSA，0.5 mM EDTA PBS 溶液，具有相应的抗体（见下文注），并在 RT 保护时孵育 15 分钟，防止光线照射。 洗涤 1x，至少 100 μL 的 2% BSA，0.5 mM EDTA PBS。 在 200 μL 中重新悬浮 2% BSA，0.5 mM EDTA PBS。 加入4’，6二胺-2-苯胺酚（DAPI，稀释1：1，000）作为活死染料。孵育3分钟 对于流细胞学分析，对主群门，然后是单个细胞，然后是活细胞。在活细胞群上，与巨噬细胞相关的标记表达式是显而易见的（图3A）。注：抗体应仔细定细，用于派生巨噬细胞的每个细胞系。结果部分中介绍的抗体在材料表中。还包括SFCi55衍生巨噬细胞流细胞测定的稀释因子。 5. 高通量噬菌体测定 通过吸气介质、加入冰冷酶自由细胞分离缓冲液、孵育5分钟，通过移液反复采集巨噬细胞，收获iPSC衍生的巨噬细胞（iPSC-DMs）。 板 8 x 10 4 iPSC-DM 在成像组织培养等级 96 井板（例如，细胞载体 Ultra，Perkin Elmer）的孔中至少 2 天，在 200 μL 的阶段 3 介质的高通量成像之前。4 通过在 2 mL PBS 中重新悬挂一个小瓶（”解决方案 1″）来制备 pHrodoGreen Zymosan-A 生物颗粒。涡旋溶液为10 s。 用更多的PBS稀释 2 mL 的 PBS 珠悬架 1：5（”解决方案 2″）。 声波溶液2 8 s 和涡旋溶液 10 s。将其保持在 4°C。此解决方案将在步骤 5.11 中使用。 拆下镀层 iPSC-DM 上的介质，然后用 PBS 清洗。 使用含有 Hoechst 33342 稀释 1：20 的 PBS 溶液染色 iPSC-DM。在37°C下孵育20分钟。 用PBS清洗细胞。 含有深红色等离子膜污渍的PBS溶液染色稀释1：1，000（参见材料表）。在37°C下孵育30分钟。 用PBS清洗细胞。 将100μL的珠溶液保持在4°C，至iPSC-DM的每个井。这些板现已准备好进行成像。 使用高含量成像系统对板材进行成像，并在井内采集三个或三个以上场位，以获得井的良好表示效果。 使用哥伦布软件（高含量成像分析系统软件）量化噬菌体。可以开发用于明确图像批处理分析的特定算法： 测量蓝色强度，并在软件中定义蓝色信号指示核。 测量红色强度，并在软件中定义红色信号指示细胞质。 定义细胞核和细胞质一起对应细胞。 测量细胞中的绿色强度，并建立严格的截止/阈值，将细胞视为噬菌体。 量化噬菌细胞分数和每个细胞的平均噬菌体指数。由于珠子的颜色强度与珠子的数量成正比，因此噬菌体活动可以通过吸收的珠子数量来衡量。 将算法/管道应用于每个场内的所有图像，并在获得的所有时间点，允许一种健壮且无偏的批处理方法来确定细胞的噬菌体能力。注：哥伦布是一种高含量分析软件，为细胞平性和功能测试提供细胞分段分析。