概要

Modello di sistema autonomo translaminare per la modulazione della pressione intraoculare e intracranica nei segmenti posteriori del donatore umano

Published: April 24, 2020
doi:

概要

Descriviamo e dettagliamo l’uso del sistema autonomo translaminare. Questo sistema utilizza il segmento posteriore umano per regolare in modo indipendente la pressione all’interno del segmento (intraoculare) e che circonda il nervo ottico (intracranico) per generare un gradiente di pressione translaminare che imita le caratteristiche della neuropatia ottica glaucomatosa.

Abstract

C’è un bisogno attualmente insoddisfatto di un nuovo modello umano preclinico in grado di indirizzare l’eziologia della malattia ex vivo utilizzando la pressione intracranica (ICP) e la pressione intraoculare (IOP) in grado di identificare vari paradigmi patogenetici correlati alla patogenesi del glaucoma. I modelli di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore anteriore umano ex vivo sono stati precedentemente utilizzati e applicati con successo come tecnologie efficaci per la scoperta della patogenesi del glaucoma e la sperimentazione di terapie. Lo screening preclinico dei farmaci e la ricerca condotta su sistemi di organi umani ex vivo possono essere più traducibili nella ricerca clinica. Questo articolo descrive in dettaglio la generazione e il funzionamento di un nuovo modello di pressione translaminare umana ex vivo chiamato sistema autonomo translaminare (TAS). Il modello TAS può regolare in modo indipendente ICP e IOP utilizzando segmenti posteriori di donatori umani. Il modello consente di studiare la patogenesi in modo preclinico. Può ridurre l’uso di animali vivi nella ricerca oftalmica. A differenza dei modelli sperimentali in vitro, la struttura, la complessità e l’integrità del tessuto della testa del nervo ottico (ONH) possono anche essere mantenute all’interno del modello TAS ex vivo.

Introduction

Stime globali in recenti sondaggi suggeriscono che 285 milioni di persone vivono con disabilità visive, tra cui 39 milioni che sono ciechi1. Nel 2010, l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha documentato che tre delle nove principali cause di cecità elencate si verificano nel segmento posteriore dell’occhio1. Le malattie oculari del segmento posteriore coinvolgono la retina, la coroide e il nervo ottico2. La retina e il nervo ottico sono estensioni del sistema nervoso centrale (SNC) del cervello. Gli assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono vulnerabili ai danni perché escono dall’occhio attraverso la testa del nervo ottico (ONH) per formare il nervo ottico3. L’ONH rimane il punto più vulnerabile per gli assoni RGC a causa della rete 3D dei fasci di tessuto connettivo chiamata lamina cribrosa (LC)4. L’ONH è il sito iniziale di insulto agli assoni RGC nel glaucoma5,6,7, e i cambiamenti di espressione genica all’interno dell’ONH sono stati studiati nei modelli di ipertensione oculare e glaucoma8,9,10. Gli assoni RGC sono sensibili all’ONH a causa dei differenziali di pressione tra il compartimento intraoculare, chiamato pressione intraoculare (IOP), e all’interno dello spazio subaracnoideo perioptico esterno, chiamato pressione intracranica (ICP)11. La regione LC separa entrambe le aree, mantenendo normali differenziali di pressione, con IOP che vanno da 10-21 mmHg e ICP da 5-15 mmHg12. La differenza di pressione attraverso la lamina tra le due camere è chiamata gradiente di pressione translaminare (TLPG)13. Un importante fattore di rischio del glaucoma è l’elevata IOP14.

L’aumento della IOP aumenta la deformazione all’interno e attraverso la regione laminare6,15,16. Osservazioni sperimentali nell’uomo e modelli animali presentano l’ONH come il sito iniziale del danno assonale17,18. Il paradigma biomeccanico dello stress correlato alla IOP e del ceppo che causa danni glaucomatosi all’ONH influenza anche la fisiopatologia del glaucoma19,20,21. Anche se nell’uomo i cambiamenti indotti dalla pressione danneggiano meccanicamente gli assoni RGC22, i roditori privi di placche collagenose all’interno della lamina possono anche sviluppare il glaucoma7,23. Inoltre, la IOP elevata rimane il fattore di rischio più importante nei pazienti con glaucoma primario ad angolo aperto, mentre i pazienti con glaucoma a tensione normale sviluppano neuropatia ottica glaucomatosa anche senza IOP elevata. Inoltre, ci sono anche un sottogruppo di pazienti ipertesi oculari che non mostrano danni al nervo ottico. È stato anche suggerito che la pressione del liquido cerebrospinale (CSFp) possa svolgere un ruolo nella patogenesi del glaucoma. L’evidenza indica che l’ICP è abbassato a ~ 5 mmHg nei pazienti con glaucoma rispetto agli individui normali, causando così un aumento della pressione translaminare e svolgendo un ruolo cruciale nella malattia24,25. In precedenza, è stato dimostrato in un modello canino, che controllando i cambiamenti IOP e CSFp, ci possono essere grandi spostamenti del disco ottico26. L’innalzamento della CSFp negli occhi suini ha anche mostrato un aumento dello sforzo principale all’interno della regione LC e del tessuto neurale retrolaminare. L’aumento della tensione sugli RGC e sulla regione LC contribuisce al blocco del trasporto assonale e alla perdita di RGC27. La progressiva degenerazione degli RGC è stata associata alla perdita del supporto trofico28,29, alla stimolazione dei processi infiammatori/regolazione immunitaria30,31 e agli effettori apoptotici29,32,33,34,35. Inoltre, la lesione assonale (Figura 3) provoca effetti dannosi sugli RGC, innescando il fallimento rigenerativo36,37,38,39. Anche se gli effetti della IOP sono stati ben studiati, sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare. La maggior parte dei trattamenti per il glaucoma si concentra sulla stabilizzazione della IOP. Tuttavia, anche se l’abbassamento della IOP rallenta la progressione della malattia, non inverte la perdita del campo visivo e previene la perdita completa di RGC. Comprendere i cambiamenti neurodegenerativi legati alla pressione nel glaucoma sarà fondamentale per prevenire la morte di RGC.

Le prove attuali indicano che le modulazioni della pressione translaminare dovute a vari cambiamenti meccanici, biologici o fisiologici in pazienti affetti da disabilità visive traumatiche o neurodegenerative possono causare una significativa perdita della vista. Attualmente, non esiste un vero modello preclinico del segmento posteriore umano che possa consentire lo studio del danno biomeccanico glaucomatoso all’interno dell’ONH umano ex vivo. L’osservazione e il trattamento del segmento posteriore dell’occhio è una sfida enorme in oftalmologia27. Esistono barriere fisiche e biologiche per colpire l’occhio posteriore, tra cui alti tassi di eliminazione, barriera emato-retinica e potenziali risposte immunologiche40. La maggior parte dei test di efficacia e sicurezza per nuovi bersagli farmacologici sono realizzati utilizzando modelli cellulari e animali in vivo in vitro41. L’anatomia oculare è complessa e gli studi in vitro non imitano accuratamente le barriere anatomiche e fisiologiche presentate dai sistemi di modelli tissutali. Anche se i modelli animali sono una necessità per gli studi di farmacocinetica, la fisiologia oculare dell’occhio posteriore umano può variare tra le varie specie animali, tra cui l’anatomia cellulare della retina, la vascolarizzazione e l’ONH41,42.

L’uso di animali vivi richiede norme etiche intensive e dettagliate, un elevato impegno finanziario e un’efficace riproducibilità43. Recentemente, sono seguite molte altre linee guida per l’uso etico degli animali nella ricerca sperimentale44,45,46. Un’alternativa alla sperimentazione animale è l’uso di modelli di occhio umano ex vivo per studiare la patogenesi della malattia e la potenziale analisi dei farmaci per proteggere i danni da ONH. Il tessuto umano post mortem è una risorsa preziosa per lo studio dei paradigmi delle malattie umane, soprattutto nel caso delle malattie neurodegenerative umane, perché l’identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali richiede la necessità di essere traducibili all’uomo47. Il tessuto del donatore umano ex vivo è stato ampiamente utilizzato per lo studio dei disturbi umani47,48,49 e i sistemi di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore umano hanno precedentemente fornito un modello ex vivo unico per studiare la fisiopatologia di IOP50,51,52 elevati.

Per studiare la pressione translaminare correlata a IOP e ICP negli occhi umani, abbiamo progettato e sviluppato con successo un sistema autonomo translaminare a due camere (TAS) in grado di regolare in modo indipendente IOP e ICP utilizzando segmenti posteriori dagli occhi dei donatori umani. È il primo modello umano ex vivo a studiare la pressione translaminare e sfruttare gli effetti biomeccanici del TLPG sull’ONH.

Questo modello TAS umano ex vivo può essere utilizzato per scoprire e classificare le modificazioni cellulari e funzionali che si verificano a causa dell’elevazione cronica della IOP o dell’ICP. In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo passo-passo di dissezione, impostazione e monitoraggio del modello del segmento posteriore umano TAS. Il protocollo consentirà ad altri ricercatori di riprodurre efficacemente questo nuovo modello di segmento posteriore umano pressurizzato ex vivo per studiare la patogenesi delle malattie biomeccaniche.

Protocol

Gli occhi sono stati ottenuti secondo le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki per la ricerca che coinvolge tessuti umani. NOTA: gli occhi di banche oculari affidabili (ad esempio, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) sono stati raccolti entro 6-12 ore dalla morte e il siero del donatore è stato testato per l’epatite B, l’epatite C e il virus dell’immunodeficienza umana 1 e 2. Una volta ricevuti, gli occhi sono stati sezionati e impostati nel modello TAS entro 24 ore…

Representative Results

Progettazione e realizzazione del sistema autonomo translaminareIl differenziale di pressione translaminare è un potenziale meccanismo chiave nella patogenesi di varie malattie, incluso il glaucoma. Gli usi per il modello descritto includono, ma non sono limitati a, lo studio del glaucoma (IOP elevata, forse ICP diminuita), lesioni cerebrali traumatiche (ICP elevato) ed esposizione a lungo termine alla compromissione visiva associata alla microgravità (ICP elevato, IOP elevato). Per aiutare a scopr…

Discussion

I tessuti umani post mortem sono una risorsa particolarmente preziosa per lo studio delle malattie neurodegenerative umane, poiché l’identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali deve essere traducibile per l’uomo47. Gli effetti dell’elevazione della IOP umana sono ben consolidati, ma sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare dell’ONH. Anche se esistono più modelli animali e modelli finiti di ONH umano, non esiste un modello uma…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il finanziamento per questo progetto è stato attraverso fondi discrezionali della dott.ssa Colleen M. McDowell. Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, Inc. al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive di UW Madison. Ringraziamo i dottori Abbot F. Clark e Weiming Mao per la loro assistenza tecnica con il modello di coltura degli organi a perfusione. Ringraziamo il Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) per aver fornito gli occhi dei donatori umani.

Materials

#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack
Amazon B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) Amazon B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle Vitality Medical 302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap QOSINA 2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver Brikksen Stainless Steel Fastners PPMSSSCH4C.5  
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE Fisher Scientific NC9085343  
Betadine Purdue PUR1815001EACH  
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167-100EA  
Corning L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS Med Plus Medical Supply COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) Katena K5-4010
Dumont #5 – Fine Forceps F.S.T. 11254-20
Eye Scissors Standard Curved Katena K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes Capitol Scientific 351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers Fisher Scientific 16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium Fisher Scientific SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution Fisher Scientific SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear Qosina 28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate AD instruments DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box Jenson Global JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope Keyence B2-X710
LabChart 8 AD instruments LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer Leica ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White QOSINA 65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228) AD instruments FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508) AD instruments PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male McMAster-Carr 7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe McMAster-Carr 51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. Fisher Scientific 14-171-268
Superblock T20 Fisher Scientific PI37536
Surgical Scissors – Sharp-Blunt F.S.T. 14001-14
Tissue Forceps Delicate 1×2 Teeth Curved Katena K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS) University of North Texas Health Science Center N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)
Marco Rubber & Plastics B1000-030

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記事を引用
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