概要

Translaminares autonomes Systemmodell zur Modulation des intraokularen und intrakraniellen Drucks in menschlichen spenderseitigen Segmenten

Published: April 24, 2020
doi:

概要

Wir beschreiben und beschreiben die Verwendung des translaminaren autonomen Systems. Dieses System nutzt das menschliche hintere Segment, um den Druck innerhalb des Segments (intraokular) und um den Sehnerv (intrakranial) unabhängig zu regulieren, um einen translaminaren Druckgradienten zu erzeugen, der Merkmale der glaukomatösen Optikusneuropathie nachahmt.

Abstract

Es besteht derzeit ein ungedeckter Bedarf an einem neuen präklinischen Humanmodell, das die Ätiologie der Krankheit ex vivo unter Verwendung von intrakraniellem Druck (ICP) und Intraokulardruck (IOP) anvisieren kann, die verschiedene pathogene Paradigmen im Zusammenhang mit der Glaukompathogenese identifizieren können. Ex-vivo-Modelle der Perfusionsorgankultur des menschlichen vorderen Segments wurden bisher erfolgreich eingesetzt und als wirksame Technologien für die Entdeckung der Glaukompathogenese und die Erprobung von Therapeutika eingesetzt. Präklinisches Arzneimittelscreening und Forschung an menschlichen Ex-vivo-Organsystemen können besser auf die klinische Forschung übertragbar sein. Dieser Artikel beschreibt detailliert die Erzeugung und den Betrieb eines neuartigen ex vivo menschlichen translaminaren Druckmodells, das als translaminares autonomes System (TAS) bezeichnet wird. Das TAS-Modell kann ICP und IOP unabhängig voneinander regulieren, indem es posteriore Segmente des menschlichen Spenders verwendet. Das Modell ermöglicht es, die Pathogenese präklinisch zu untersuchen. Es kann den Einsatz lebender Tiere in der ophthalmologischen Forschung reduzieren. Im Gegensatz zu experimentellen In-vitro-Modellen können auch die Gewebestruktur, -komplexität und -integrität des Sehnervenkopfes (ONH) innerhalb des ex vivo TAS-Modells aufrechterhalten werden.

Introduction

Globale Schätzungen in jüngsten Umfragen deuten darauf hin, dass 285 Millionen Menschen mit Sehbehinderung leben, darunter 39 Millionen, die blind sind1. Im Jahr 2010 dokumentierte die Weltgesundheitsorganisation, dass drei der neun aufgeführten Hauptursachen für Erblindung im hinteren Segment des Auges auftreten1. Augenerkrankungen des hinteren Segments betreffen die Netzhaut, die Aderhaut und den Sehnerv2. Die Netzhaut und der Sehnerv sind Erweiterungen des Gehirns des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Axone der retinalen Ganglienzellen (RGC) sind anfällig für Schäden, da sie das Auge durch den Sehnervenkopf (ONH) verlassen, um den Sehnerv zu bilden3. Das ONH bleibt der anfälligste Punkt für die RGC-Axone aufgrund des 3D-Geflechts von Bindegewebsstrahlen, die als Lamina cribrosa (LC)4 bezeichnet werden. Das ONH ist der erste Ort der Beleidigung von RGC-Axonen bei Glaukom5,6,7, und Genexpressionsänderungen innerhalb des ONH wurden in okulären Hypertonie- und Glaukommodellen untersucht8,9,10. Die RGC-Axone sind am ONH aufgrund von Druckunterschieden zwischen dem intraokularen Kompartiment, dem sogenannten Augeninnendruck (IOP), und innerhalb des externen perioptischen Subarachnoidalraums, dem sogenannten intrakraniellen Druck (ICP)11, anfällig. Der LC-Bereich trennt beide Bereiche unter Beibehaltung der normalen Druckunterschiede, wobei der IOD zwischen 10 und 21 mmHg und der ICP zwischen 5 und 15 mmHg12 liegt. Die Druckdifferenz durch die Lamelle zwischen den beiden Kammern wird als translaminarer Druckgradient (TLPG)13 bezeichnet. Ein Hauptrisikofaktor des Glaukoms ist ein erhöhter IOP14.

Ein erhöhter IOD erhöht die Belastung innerhalb und über die laminare Region6,15,16. Experimentelle Beobachtungen in Menschen- und Tiermodellen stellen das ONH als den ersten Ort axonaler Schäden dar17,18. Das biomechanische Paradigma des IOD-bedingten Stresses und der Belastung, die am ONH glaukomatöse Schäden verursachen, beeinflusst auch die Pathophysiologie des Glaukoms19,20,21. Obwohl beim Menschen druckbedingte Veränderungen die RGC-Axone mechanisch schädigen22, können Nagetiere, denen kollagene Platten in der Lamina fehlen, auch ein Glaukom entwickeln7,23. Darüber hinaus bleibt ein erhöhter IOD der prominenteste Risikofaktor bei Patienten mit primärem Offenwinkelglaukom, während normale Spannungsglaukompatienten auch ohne erhöhten IOD eine glaukomatöse Optikusneuropathie entwickeln. Darüber hinaus gibt es auch eine Untergruppe von okulären hypertensiven Patienten, die keine Sehnervenschädigung zeigen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass der Liquordruck (CSFp) eine Rolle bei der Glaukompathogenese spielen kann. Es gibt Hinweise darauf, dass der ICP bei Glaukompatienten im Vergleich zu normalen Personen auf ~ 5 mmHg gesenkt wird, wodurch ein erhöhter translaminarer Druck verursacht wird und eine entscheidende Rolle bei der Erkrankung spielt24,25. Zuvor wurde in einem Hundemodell gezeigt, dass es durch die Kontrolle von IOP- und CSFp-Änderungen zu großen Verschiebungen der optischen Disc26 kommen kann. Die Erhöhung des LIQUOR in den Augen von Schweinen hat auch eine erhöhte Hauptbelastung innerhalb der LC-Region und des retrolaminaren Nervengewebes gezeigt. Eine erhöhte Belastung der RGCs und der LC-Region trägt zur axonalen Transportblockade und zum Verlust von RGCs bei27. Die fortschreitende Degeneration von RGCs wurde mit dem Verlust der trophischen Unterstützung28,29, der Stimulation von Entzündungsprozessen/Immunregulation30,31 und apoptotischen Effektoren in Verbindung gebracht29,32,33,34,35. Darüber hinaus verursacht eine axonale Verletzung (Abbildung 3) schädliche Auswirkungen auf die RGCs und löst ein regeneratives Versagen aus36,37,38,39. Obwohl die Auswirkungen von IOD gut untersucht wurden, wurden nur minimale Untersuchungen zu abnormalen translaminaren Druckänderungen durchgeführt. Die meisten Behandlungen für Glaukom konzentrieren sich auf die Stabilisierung des IOD. Obwohl die Senkung des IOD das Fortschreiten der Krankheit verlangsamt, kehrt sie den Gesichtsfeldverlust nicht um und verhindert den vollständigen Verlust von RGCs. Das Verständnis druckbedingter neurodegenerativer Veränderungen des Glaukoms wird entscheidend sein, um den Tod durch RGC zu verhindern.

Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass translaminare Druckmodulationen aufgrund verschiedener mechanischer, biologischer oder physiologischer Veränderungen bei Patienten mit traumatischen oder neurodegenerativen Sehstörungen zu einem erheblichen Sehverlust führen können. Derzeit existiert kein echtes präklinisches modell für das menschliche hintere Segment, das die Untersuchung von glaukomatösen biomechanischen Schäden innerhalb des ex vivo humanen ONH ermöglichen könnte. Die Beobachtung und Behandlung des hinteren Augenabschnitts ist eine große Herausforderung in der Augenheilkunde27. Es gibt physikalische und biologische Barrieren, die auf das hintere Auge abzielen, einschließlich hoher Eliminationsraten, Blut-Netzhaut-Barriere und potenzieller immunologischer Reaktionen40. Die meisten Wirksamkeits- und Sicherheitstests für neuartige Wirkstoffziele werden unter Verwendung von In-vitro-Zell- und In-vivo-Tiermodellen durchgeführt41. Die Augenanatomie ist komplex, und In-vitro-Studien ahmen die anatomischen und physiologischen Barrieren von Gewebemodellsystemen nicht genau nach. Obwohl Tiermodelle eine Notwendigkeit für pharmakokinetische Studien sind, kann die Augenphysiologie des menschlichen hinteren Auges zwischen verschiedenen Tierarten variieren, einschließlich der zellulären Anatomie der Netzhaut, des Gefäßsystems und ONH41,42.

Die Verwendung lebender Tiere erfordert intensive und detaillierte ethische Vorschriften, ein hohes finanzielles Engagement und eine effektive Reproduzierbarkeit43. In jüngster Zeit sind mehrere weitere Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren in der experimentellen Forschung entstanden44,45,46. Eine Alternative zu Tierversuchen ist die Verwendung von Ex-vivo-Modellen des menschlichen Auges zur Untersuchung der Krankheitspathogenese und der Potenzialanalyse von Arzneimitteln zum Schutz von ONH-Schäden. Menschliches postmortales Gewebe ist eine wertvolle Ressource für die Untersuchung menschlicher Krankheitsparadigmen, insbesondere im Fall von humanen neurodegenerativen Erkrankungen, da die Identifizierung potenzieller Medikamente, die in Tiermodellen entwickelt wurden, die Notwendigkeit erfordert, auf den Menschen übertragbar zu sein47. Das menschliche Ex-vivo-Spendergewebe wurde umfassend für die Untersuchung menschlicher Störungen verwendet47,48,49, und menschliche Perfusionsorgankultursysteme für das vordere Segment haben zuvor ein einzigartiges Ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie von erhöhtem IOP50,51,52 bereitgestellt.

Um den translaminaren Druck im Zusammenhang mit IOD und ICP im menschlichen Auge zu untersuchen, haben wir erfolgreich ein translaminares autonomes Zweikammersystem (TAS) entworfen und entwickelt, das IOD und ICP unabhängig voneinander regulieren kann, indem wir posteriore Segmente von menschlichen Spenderaugen verwenden. Es ist das erste Ex-vivo-Humanmodell, das den translaminaren Druck untersucht und die biomechanischen Wirkungen von TLPG auf das ONH nutzt.

Dieses ex vivo humane TAS-Modell kann verwendet werden, um zelluläre und funktionelle Modifikationen zu entdecken und zu klassifizieren, die aufgrund einer chronischen Erhöhung von IOD oder ICP auftreten. In diesem Bericht beschreiben wir das Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Sezieren, Einrichten und Überwachen des TAS-Modells des menschlichen hinteren Segments. Das Protokoll wird es anderen Forschern ermöglichen, dieses neuartige Ex-vivo-Druckmodell des menschlichen hinteren Segments effektiv zu reproduzieren, um die pathogenese biomechanischer Erkrankungen zu untersuchen.

Protocol

Die Augen wurden gemäß den Bestimmungen der Deklaration von Helsinki für die Forschung mit menschlichem Gewebe gewonnen. HINWEIS: Augen aus seriösen Augenbanken (z. B. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) wurden innerhalb von 6-12 Stunden nach dem Tod geerntet und Spenderserum wurde auf Hepatitis B, Hepatitis C und das humane Immunschwächevirus 1 und 2 getestet. Sobald sie eingegangen waren, wurden die Augen innerhalb von 24 Stunden im TAS-Modell seziert und eingerichte…

Representative Results

Design und Kreation des translaminaren autonomen SystemsDie translaminare Druckdifferenz ist ein potenzieller Schlüsselmechanismus in der Pathogenese verschiedener Krankheiten, einschließlich glaukom. Zu den Anwendungen des beschriebenen Modells gehören unter anderem die Untersuchung von Glaukom (erhöhter IOD, möglicherweise verminderter ICP), traumatischer Hirnverletzung (erhöhter ICP) und langfristiger Exposition gegenüber schwerelosigkeitsassoziierter Sehbehinderung (erhöhter ICP, erhöhte…

Discussion

Menschliches postmortales Gewebe ist eine besonders wertvolle Ressource für die Erforschung humaner neurodegenerativer Erkrankungen, da die Identifizierung potenzieller Medikamente, die in Tiermodellen entwickelt wurden, auf den Menschen übertragbar sein muss47. Die Auswirkungen der menschlichen IOD-Erhöhung sind gut belegt, aber es wurden nur minimale Untersuchungen zu abnormalen ONH-translaminaren Druckänderungen durchgeführt. Obwohl mehrere Tiermodelle und endliche Modelle des menschlichen…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung dieses Projekts erfolgte durch Ermessensfonds von Dr. Colleen M. McDowell. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, Inc. an das UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences unterstützt. Wir danken Drs. Abt F. Clark und Weiming Mao für ihre technische Unterstützung mit dem Perfusionsorgankulturmodell. Wir danken dem Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) für die Bereitstellung der menschlichen Spenderaugen.

Materials

#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack
Amazon B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) Amazon B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle Vitality Medical 302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap QOSINA 2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver Brikksen Stainless Steel Fastners PPMSSSCH4C.5  
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE Fisher Scientific NC9085343  
Betadine Purdue PUR1815001EACH  
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167-100EA  
Corning L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS Med Plus Medical Supply COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) Katena K5-4010
Dumont #5 – Fine Forceps F.S.T. 11254-20
Eye Scissors Standard Curved Katena K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes Capitol Scientific 351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers Fisher Scientific 16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher Scientific 01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium Fisher Scientific SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution Fisher Scientific SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear Qosina 28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate AD instruments DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box Jenson Global JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope Keyence B2-X710
LabChart 8 AD instruments LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer Leica ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White QOSINA 65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228) AD instruments FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508) AD instruments PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male McMAster-Carr 7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe McMAster-Carr 51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. Fisher Scientific 14-171-268
Superblock T20 Fisher Scientific PI37536
Surgical Scissors – Sharp-Blunt F.S.T. 14001-14
Tissue Forceps Delicate 1×2 Teeth Curved Katena K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS) University of North Texas Health Science Center N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)
Marco Rubber & Plastics B1000-030

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記事を引用
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