定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

1. マウス胚性幹細胞からの胚性の体生成 MESC無血清培地を調製:DMEM/F12および神経基底培地を1:1の割合で混合した。培地は、MEM非必須アミノ酸溶液(1x)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、L-グルタミン(2mM)、ペニシリンストレプトマイシン(100 U/mL)、β-メルカプトエタノールを添加した。 (50 μM)、N2およびB27サプリメント(1x)、PD0325901(1 μM)、CHIR99021(3μM)、白血病阻害因子(LIF)(1,000 U/mL)。 EB分化培地を調製する:DMEMは10%胎児ウシ血清(FBS)、MEM非必須アミノ酸(1x)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、L-グルタミン(2mM)、ペニシリンストレプトマイシン(100 U/mL)、β-メルカプトエタノール(50μM)を添加した。 mESC培養液中に0.1%(w/v)ゼラチンをあらかじめコーティングした10cmプラスチック皿の培養メック。 mESCが60%の合流度に達したら、培養培地を取り除き、2mLの殺菌されたPBSで1倍静かに洗います。 PBSを完全に取り除き、2 mLの細胞剥離培地を加えます。培養皿を37°Cで5分間インキュベートします。 8 mLのEB分化培地をディッシュに加えて反応を不活性化する。 mESCコロニーを上下15〜20回ピペット化して単細胞懸濁液を得た。 室温(RT)で300xgのg細胞を5分間遠心し、上清を慎重に取り除きます。 カウント細胞(例えば、ヘモサイトメーターを用いて)。 細胞ペレットをEB分化培地で再懸濁し、濃度を2 x 104細胞/mLに調整します。 15 cm培養皿の蓋を反転させ、200 μLのマルチチャンネルピペットを使用して、20 μLの再懸濁液(約400細胞/ドロップ)を蓋に堆積させます。 蓋を慎重に底のチャンバーに反転させ、37°Cの吊り下げ液で3日間、CO2と湿度95%で3日間インキュベートします。 10 mLのPBSで蓋を軽く洗い、EB含有懸濁液を50mLのプラスチックチューブに移して、EBを回収します。 チューブをRTに30分間置き、重力で底に沈みます。上清を慎重に取り除いてください。 新鮮なEB分化培地10mLでEBを穏やかに再中断し、10cmの細菌学的ペトリ皿に移します。 逆顕微鏡を使用して、3-6日後にEB形成を確認してください。生成される EJB は、丸く、同種のサイズにする必要があります。 5%CO2と95%の湿度で37°C2で培養をインキュベートします。EB は 3 つの胚芽層に対して引き続き区別され、さまざまなタイムポイントで解析できます。 2. エブの解離 2~3個の10cmの皿から50mLのプラスチックチューブにEBを集めろ。5分間RTで300 x gでエブを遠心分離し、慎重に上清を取り除きます。 10 mL の PBS で EJB を再中断します。遠心分離機のエブはRTで300×gで3分間、上清を取り除く。 g トリプシン-EDTAの2 mLを追加する(0.25%)ペレットにし、37 °Cで15分間チューブをインキュベートし、ピペットを3分間上下にして単一細胞懸濁液を得る。 8 mLのEB分化培地を加えてトリプシン反応を停止します。EBの解離を顕微鏡で確認し、細胞を数えます。 3. 固定 1 x 106細胞/mLで新鮮なEB培養培地中の細胞を再懸濁する。50 mL チューブの場合、最大 4.5 x 107 個のセルを 45 mL の培地に使用します。 37%の在庫(6ヶ月以上前ではない)からパラホルムアルデヒドを1%の最終濃度に加えます。注意:パラホルムアルデヒドは有害な化学物質であるため、適切な安全衛生規則に従い、パラホルムアルデヒドを取り扱ってください。 回転の下でRTで10分間インキュベートします。 0.125 Mの最終濃度にグリシンを加えてホルムアルデヒドをクエンチする。 回転の下でRTで5分間インキュベートします。 固い細胞を氷に移し、これから4°Cで冷たく保ちます。 細胞を冷蔵遠心分離機でg5分間300xgでペレット化する。 上清を捨てて、冷たいPBS(5 x 106細胞の1mL)でペレットを再懸濁し、1.5 mLの安全ロックチューブに移します。 4°Cで5分間300xgの細胞をペレットにし、上清を捨て、ペレットを液体窒素中でスナップフリーズします。 g-80°Cで保存するか、以下のプロトコルに進みます。 4. 細胞の分解と制限酵素の消化 細胞ペレットを、調製したばかりの氷冷リシスバッファー(10 mM Tris-HCl pH = 8.0、10 mM NaCl、0.2%イゲパルCA630、および1xプロテアーゼ阻害剤)を2〜5 x 106細胞あたり0.25 mLに静かに再懸濁します。5 mL のリシスバッファーを準備するには、表 1を参照してください。 氷の上で15分間細胞をインキュベートします。 遠心分離機 1,000 x gで 5 分 4 °C.上清を捨てて、核を含むペレットを保管してください。 ペレット化した核を500 μLの冷たいリシスバッファーで洗浄します。 ペレットを0.5%SDSの50 μLの1.5mLチューブ内の1xバッファ2に静かに再懸濁し、62°Cの加熱ブロックで10分間チューブをインキュベートします。 加熱ブロックからチューブを取り出し、10%トリトンX-100の25 μLを含む170 μLの消化バッファーを加え、SDSを急冷します。過度の発泡を避け、ピペットでよく混ぜます。 37°Cで15分間インキュベートします。 25 μLの消化バッファーを加え、反転して混合し、未消化制御として8 μLを取ります。未消化の対照試料を-20°Cに保ちます。残りの核に100 U MboI制限酵素(25 U/μLストックの4μL)を加え、クロマチンを37°Cで2時間、回転下で消化します。MboIの100 Uの別のアリコートを追加し、さらに2時間インキュベートします。 さらに100 UのMboIを加え、37°Cで一晩回転してインキュベートする。 翌日、さらに100 UのMboIを加え、37°Cで3時間インキュベートします。 8 μLを消化された対照サンプルとして取ります。80 μLのTEバッファー(10 mM Tris pH = 8,1 mM EDTA)および10 μLのプロテイナーゼK(10 mg/mL)を加えることで、ステップ4.8から脱架橋された制御サンプルおよび未消化制御サンプル。65°Cで1時間インキュベートする。 0.6%のゲルで20 μLのアリコートを実行し、消化効率を確認します。正常なダイジェストは、主に3.0-0.5 kbの範囲の断片を示しています。 5. 近接ライゲーションと架橋反転 MboI消化サンプルを加熱ブロックで65°Cで20分間インキュベートし、MboIを不活性化し、RTに冷却します。 RTで1,000 x gで5分間チューブを遠心し、上清を取り除き、ペレットを200μLの新鮮なリガーゼバッファーに溶解します。 各サンプルに1,000 μLのライゲーションマスターミックスを加えます。ライゲーションマスターミックスの1,000 μLを調製するには、表2を参照してください。 転向して混ぜ、遅い回転(9 rpm)でRTの夜にインキュベートする。 RNAおよびタンパク質残基を除去するには、100 μLのプロテイナーゼK(10 mg/mL)と10μLのRNase A(10 mg/mL)を加えて下さいます。サンプルを55°Cで45~60分間インキュベートします。 65°Cでサンプルを4時間続けて続けます。 6. DNAのせん断とサイズの選択 RTに冷却チューブ。 遠心分離機 1,000 x gで 4 °C で 5 分間 サンプルを2mLチューブ内の3つの400 μLアリコートに分割し、2μLのグリコーゲン(20mg/m)、40μLの酢酸ナトリウム(3M、pH = 5.2)、各チューブに100%エタノールの2.5倍の体積(1mL)を加えます。反転して混ぜ、-80°Cで45〜60分間インキュベートします。 4°Cで16,000 x gの遠心分離機を25分間回転させた後、チューブを氷の上に置き、ピペットで慎重に上清を取り除きます。 70%エタノールの800 μLで再懸濁してDNAペレットを洗浄します。遠心分離機 16,000 x gで 4 °C で 5 分間 上清を取り除き、70%エタノールの800 μLでもう一度洗浄を行います。 ペレットを1xトリスバッファー(10 mM Tris-HCl、pH =8)の130 μLに溶解し、37°Cで15分間インキュベートしてDNAを完全に溶解します。必要に応じて、ピペットを使用して沈殿物を再中断します。 DNAの収量を測定します。2.5~5 μgのクロマチンは、1 x 106個の細胞に対して期待できます。3C製品の±200 ngを0.6%アガロースゲルで実行してライゲーションを確認します。成功したライゲーションは、主にDNA断片を示す > 3 kb.サンプルは-20°Cで保存してください。 1x Trisバッファボリューム(1μg)の100 μLで10ng/μLの超音波処理に適した0.65 mLチューブでサンプルを希釈します。ライブラリの準備に使用される標準的な量は3 μgですので、必要に応じて3つの別々のチューブで超音波処理を行います。 超音波器上の次のパラメータを使用して150-700 bp(平均= 400-500 bp)のサイズにDNAを剪断:サイクル:60 sオフの20 sの6-8。これにより、Illuminaシーケンサーを使用したハイスループットシーケンシングライブラリ調製に適したDNAが得られます。 シアドDNAを通常の新しいセーフロックチューブに移します。同じサンプルから複数の超音波処理をプールします。 RTでDNA精製ビーズのボトルを温めます。これからは、低いバインドのヒントを使用します。 1.8倍のビーズをDNAチューブに加え、穏やかに再中断します。 RTで5分間インキュベートします。 磁気ラックでビーズを収集します。マグネティックラックにチューブを入したまま、作りたての80%エタノールを1mLでビーズ2倍洗います。注:残留液滴を含むすべてのエタノールを除去します。 RTでビーズを短時間(2〜3分)空気乾燥させます。注:5分以上のビーズを乾燥させないでください。これによりDNA収率が低下します。 90 μL の 1x Tris バッファー (10 mM Tris-HCl、pH = 8) のビーズを再中断して、DNA を溶出します。 DNAの収率を測定し、1.5%ゲルで5μLアリコートを分析します。予音前の収量に比べて非常に少ない損失があるはずです。 7. シーケンシングのためのライブラリの準備 ライブラリ準備キットから15 μLのマスターミックスを追加します。せわされたDNAの末端を修復するには、10倍末修復反応バッファーの10 μLと5 μLのエンドリペア酵素ミックスを組み合わせます。 RTで30分間インキュベートします。 1.1倍のDNA精製ビーズを加え、穏やかに再懸濁します。 RTで5分間インキュベートします。 磁気ラックでビーズを収集します。マグネティックラックにチューブを入したまま、1 mLの新しく作りたての80%エタノールでビーズを2回洗います。エタノールを取り除く。 RTでビーズを2〜3分間エアドライし、42 μLの1x Trisバッファ(10 mM Tris-HCl、pH =8)でビーズを再中断してDNAを溶出させます。 各サンプルに8μLのdA-tailingマスターミックスを加えます。dA-tailingマスターミックスを準備するには、5 μLの10倍のdA-テーリング反応バッファーと3 μLのクレノウフラグメントエキソマイナスを組み合わせます。 37°Cで30分間インキュベートします。 2μLの子牛の腸内アルカリホスファターゼ(CIP)を加えてDNAを脱リン酸化します。 37°Cで30分間インキュベートし、50°Cで60分インキュベートします。 1.1倍のDNA精製ビーズを加え、穏やかに再懸濁します。 RTで5分間インキュベートします。 磁気ラックでビーズを収集します。マグネティックラックにチューブを入したまま、作りたての80%エタノールを1mLでビーズ2倍洗います。 RTでビーズを短時間(2〜3分)空気乾燥します。35 μLの1x Trisバッファ(10 mM Tris-HCl、pH = 8)のビーズを再中断してDNAを溶出させます。 アダプターライゲーション反応を行います。表 3に示すように、アダプター/リガーゼ濃度を低減して使用します。 20°Cで15分間インキュベートします。 ウラシルDNAグリコシラーゼとDNAグリコシラーゼエンドヌクレアーゼVII(例えば、USER)酵素の混合物の3μLを加え、ピペット処理によって混合し、37°Cで15分間インキュベートする。 水で100μLにボリュームを上げ、96°Cで5分沸騰させ、サンプルを氷の上に置きます。 1.1倍のDNA精製ビーズを加え、穏やかに再懸濁します。 RTで5分間インキュベートします。 磁気ラックでビーズを収集します。マグネティックラックにチューブを入したまま、作りたての80%エタノールを1mLでビーズ2倍洗います。 RTでビーズを2〜3分間エアドライし、50 μLの1x Trisバッファ(10 mM Tris-HCl、pH = 8)でビーズを再中断してDNAを溶出させます。 8. 4Cクロマチン相互作用ライブラリの増幅と精製 10 μLのライブラリを使用して4Cライブラリを増幅し、最初のPCRを実行します。PCR のセットアップとプログラムは、表 4を参照してください。 入れ子になった PCR を実行します。ネストされた PCR のセットアップとプログラムは、表 5を参照してください。 各ライブラリーの PCR 製品をプールし、1.1x DNA 精製ビーズで精製します。 DNAの収率を測定し、1.5%ゲルで5μLアリコートを分析します。 ライブラリの濃度を調整し、ライブラリをシーケンスします。インデックスが作成されている場合、ライブラリはシーケンスの前にプールできます。