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医学

Verwendung einer chemischen Biopsie zur Graft-Qualitätsbewertung

Published: June 17, 2020
doi:
10.3791/60946
, , , , , , , , ,
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy,Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery,Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz,Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4医学部,Toronto General Hospital

概要

Das Protokoll stellt die Anwendung des chemischen Biopsieansatzes dar, gefolgt von einer umfassenden metatobiomischen und lipidomischen Analyse zur Qualitätsbewertung von Nierentransplantaten, die für die Transplantation zugeteilt wurden.

Abstract

Nierentransplantation ist eine lebensrettende Behandlung für eine große Anzahl von Menschen mit Nierenfunktionsstörungen im Endstadium weltweit. Das Verfahren ist mit einer erhöhten Überlebensrate und einer höheren Lebensqualität des Patienten im Vergleich zur herkömmlichen Dialyse verbunden. Bedauerlicherweise leidet die Transplantologie unter einem Mangel an zuverlässigen Methoden für die Bewertung der Organqualität. Standarddiagnostikverfahren beschränken sich auf makroskopische Erscheinungsbildinspektionen oder invasive Gewebebiopsien, die keine umfassenden Informationen über das Transplantat liefern. Das vorgeschlagene Protokoll zielt darauf ab, die Festphasenmikroextraktion (SPME) als ideale Analysemethode für eine umfassende metabolome und lipidomische Analyse aller niedermolekularen Verbindungen in Nieren einzuführen, die für die Transplantation zugewiesen sind. Die geringe Größe der SPME-Sonde ermöglicht die Durchführung einer chemischen Biopsie, die die Extraktion von Metaboliten direkt aus dem Organ ohne Gewebeentnahme ermöglicht. Die minimale Invasivität des Verfahrens ermöglicht die Durchführung mehrerer Analysen im Laufe der Zeit: direkt nach der Organentnahme, während ihrer Konservierung und unmittelbar nach der Revaskularisation am Körper des Empfängers. Es wird vermutet, dass die Kombination dieser neuartigen Probenahmemethode mit einem hochauflösenden Massenspektrometer die Diskriminierung einer Reihe von charakteristischen Verbindungen ermöglichen wird, die als biologische Marker der Transplantatqualität und Indikatoren für eine mögliche Entwicklung von Organfunktionsstörungen dienen könnten.

Introduction

Nach Angaben des United States Organ Procurement and Transplantation Network warteten 2019 in den USA 94.756 Patienten auf Nierentransplantationen. in Europa waren es 2018 10.791. Alle zehn Minuten wird jemand auf die nationale Warteliste für Transplantationen in den USA gesetzt, und es wird geschätzt, dass jeden Tag 20 Menschen sterben, die auf eine Transplantation warten1,2. Nierentransplantation ist eine lebensrettende Behandlung für eine große Anzahl von Menschen mit Nierenfunktionsstörungen im Endstadium weltweit. Das Verfahren ist mit einer erhöhten Überlebensrate und einer höheren Lebensqualität im Vergleich zur konventionellen Dialyse verbunden.

Die Transplantation steht jedoch vor vielen ernsten Problemen, wie z. B. Organmangel oder mangels wirksamer Instrumente für die Bewertung der Organqualität. Die Standardprotokolle beschränken sich auf makroskopische Erscheinungsbildinspektionen oder invasive Gewebebiopsien, die keine umfassenden Informationen über die Qualität des Transplantats liefern. Während eine visuelle Beurteilung die Identifizierung von tumoren ermöglicht, die für das Auge sichtbar sind, anatomische Anomalien oder umfangreiche Schäden an den Transplantaten, ist dieser Ansatz sehr subjektiv, unterschiedlich in seiner Wirksamkeit nach der Erfahrung der Beobachter. Biopsie hingegen kann wertvolle Informationen über bereits bestehende Nierenerkrankungen liefern und gilt daher als eine Methode von objektivem und nachgewiesenem Wert bei der Bestimmung der Transplantatergebnisse. Das Biopsieverfahren ist jedoch nicht frei von Fehlern; es besteht das Risiko möglicher Komplikationen wie Blutungen und eine zusätzliche 4-5 Stunden Probenvorbereitung ist erforderlich, was die kalte ischämische Zeit signifikant verlängert. Daher beschränkt sich die Anwendung der direkten Gewebeanalyse insbesondere in Europa auf erweiterte Kriterien spender (ECD) und Spender nach Kreislauftod (DCD)3,4.

Metabolomik und Lipidomik wurden vor kurzem als vielversprechende Ansätze anerkannt, um ein besseres Verständnis der Veränderungen der biochemischen Bahnen zu erreichen, die während der Organkonservierung auftreten. Metabolomic und lipidomic Profiling ermöglicht die Überwachung der sofortigen Reaktionen des Systems auf plötzliche Umweltveränderungen im Zusammenhang mit Organentfernung mit nachfolgenden Folgen: Ischämie, oxidativer Stress, oder Entzündungsreaktionen5,6,7,8. Die Niere ist ein Organ, das weitgehend mit Stoffwechselprozessen verbunden ist, so dass Messungen von Metaboliten und Lipidkonzentrationen die Identifizierung potenzieller Biomarker der Organqualität ermöglichen und bessere Vorhersagen des Transplantatergebnisses ermöglichen.

Angesichts der oben genannten Komplikationen und Einschränkungen im Zusammenhang mit aktuellen Methoden zur Beurteilung der Organqualität ist eine weniger invasive diagnostische Lösung für eine schnelle und komplexe Beurteilung der Organqualität erforderlich. Die Solid Phase Microextraction (SPME) erfüllt diese Anforderungen als minimalinvasive Analysemethode, die die Abdeckung eines breiten Spektrums von Metaboliten und Lipiden ermöglicht. Die Technik basiert auf dem Einbringen einer dünnen, biokompatiblen, Titan-Nickel-Legierungssonde, die kurzzeitig mit einer selektiven Extraktionsphase in das untersuchte Organ eingebunden ist. Es sollte betont werden, dass SPME die Proteinextraktion verhindert und somit eine Stoffwechselhemmung bereits im Stadium der Probenentnahme ermöglicht, was ein wesentlicher Vorteil gegenüber alternativen Methoden ist. Darüber hinaus ermöglicht die Miniaturisierung des Gerätes die Durchführung von sich wiederholenden und simultanen Analysen von wenigen Strukturen des Organs9,10,11.

Protocol

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den “Prinzipien der Labortierpflege” der National Society for Medical Research und dem vom National Institute of Health, Ontario, Kanada, veröffentlichten “Guide for the Care of Laboratory Animals”” human behandelt. Der Animal Care Committee des Toronto General Research Institute genehmigte alle Studien. Die Forschung, an der Menschen beteiligt waren, wurde vom Bioethischen Komitee am Collegium Medicum in der Bydgoszcz Nicolaus Copernicus Universität in Torun genehmigt. HINWEIS: Erhalten Sie die Genehmigung von geeigneten ethischen Gremien. Denken Sie daran, immer Sicherheitshandschuhe zu tragen. Berühren Sie nicht die Extraktionsphase von SPME-Sonden. Die Verwendung deaktivierter Glasfläschchen wird für lipidomische Analysen empfohlen. 1. Vorbereitung der Sonden Bereiten Sie Titan-Nickel-Legierungssonden (40 mm Länge; 0,2 mm Durchmesser) mit 7 mm Mischmodus-Sorbens beschichtet. Die Anzahl der Prüfpunkte hängt von den während des gesamten Vorgangs angestrebten Zeitpunkten und der Anzahl der Replikationen ab (3 wird pro Zeitpunkt empfohlen).HINWEIS: Die Länge und Art der Extraktionsphase kann basierend auf der Art der Untersuchung, der Polarität der Metaboliten und der Probenmatrix angepasst werden. Bereiten Sie ein Reinigungsgemisch aus 2:1 Chloroform: Methanol (v/v) vor. Pipetten Sie 1,0 ml der Lösung für jede 2,0 ml Glasdurchstechflasche und legen Sie eine Sonde, zuvor durch die Kappe durchbohrt, in jede Durchstechflasche.HINWEIS: Reinigen Sie vor der Verwendung alle Sonden, um kontaminierende Partikel zu entfernen. Setzen Sie die Fläschchen auf den Rühror und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 1.200 Rpm. Nach 45 min das Gerät anhalten und die Beschichtungen mit WASSER der LC-MS-Klasse ausspülen. Da Beschichtungen einem Vorbedingungsschritt unterzogen werden müssen, um sie zu aktivieren, bereiten Sie ein Vorkonditionierungsgemisch vor, das aus 1:1 Methanol:Wasser (v/v) besteht. Pipetten Sie 1,0 ml der Lösung für jede 2,0 ml Glasdurchstechflasche und legen Sie eine Sonde, zuvor durch die Kappe durchbohrt, in jede Durchstechflasche. Setzen Sie die Fläschchen auf den Wirbelrührer und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 1.200 Rpm. Nach 60 min den Rührer anhalten und die Beschichtungen mit WASSER der LC-MS-Klasse abspülen. Sterilisieren Sie Sonden nach dem Standard-Sterilisationsprotokoll für chirurgische Geräte. 2. Extraktion Öffnen Sie die sterile Verpackung direkt vor der Probenahme, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten. Setzen Sie zwei Sonden zu jedem Zeitpunkt für jeweils 10 min direkt in den Nierenkortex ein. Die gesamte Länge der Beschichtung muss von der Gewebematrix abgedeckt werden; es ist kein spezifischer Winkel erforderlich, sondern in der Regel werden ca. 90 Grad verwendet.HINWEIS: Das gesamte medizinische Verfahren folgt DenStandardprotokollen in einer bestimmten Einrichtung. Es wird keine Änderung der SPME-Probenahme berücksichtigt. Das Verfahren umfasst die folgenden sechs Probenahmezeitpunkte:a) vor der Nierenresektion in vivo vom Spender;b)-e) nach 1 h, 3 h, 5 h, 7 h Nierenperfusion, ex vivo in der Organkammer;f) nach der Reperfusion in vivo vom Empfänger. Ziehen Sie die Sonden zurück, indem Sie sie aus dem Gewebe herausziehen, und spülen Sie dann Beschichtungen mit WASSER der LC-MS-Klasse, um das verbleibende Blut von der Beschichtungsoberfläche zu entfernen. Spülen Sie weg von der chirurgischen Stelle, und sofort nach der Entfernung der Sonden. 3. Transport und Lagerung Legen Sie Sonden in separate Durchstechflaschen und schließen Sie sie. Fläschchen in eine Styroporbox geben, die mit Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff für den Transport gefüllt ist. Proben in einem Gefrierschrank (-80 °C) aufbewahren oder sofort mit dem Desorptionsschritt beginnen. 4. Desorption Vorbereiten von Desorptionslösungen bestehend aus 80:20 Acetonitril:Wasser (v/v) für die metabolomische Analyse und 1:1 Isopropanol:Methanol (v/v) für die lipidomische Analyse. Pipetten Sie 100 l der Lösung für Einsätze, die in 2,0 ml beschriftete Durchstechflaschen gelegt werden, und legen Sie eine Sonde, die zuvor durch die Kappe durchbohrt wurde, in jede Durchstechflasche. Setzen Sie die Fläschchen auf den Wirbelrührer und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit für 120 min auf 1.200 Rpm ein. Entfernen Sie Sonden von den Durchstechflaschen. Erhaltene Auszüge sind nun für die instrumentelle Analyse bereit. 5. LC-MS-Analyse Legen Sie Fläschchen mit Extrakten in den Autosampler des LC-MS-Systems.HINWEIS: Für diese Studie wurden Flüssigchromatographie (RP, HILIC) in Verbindung mit hochauflösender Massenspektrometrie und einem Orbitrap-Massenanalysator verwendet. Für metabolomische Analyseparameter gehen Sie zu Schritt 5.2. Gehen Sie für lipidomische Analyseparameter zu Schritt 5.6. Verwenden Sie eine Pentafluorphenylsäule (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 m) für die umgekehrte Phasentrennung. Stellen Sie den Durchfluss auf 300 l/min und die Autosampler- und Säulentemperaturen auf 4 °C bzw. 25 °C ein. Bereiten Sie mobile Phasen nach folgenden Proportionen vor: mobile Phase A: Wasser:Ameisensäure (99,9:0,1, v/v) und mobile Phase B: Acetonitril:Ameisensäure (99,9:0,1, v/v). Stellen Sie den mobilen Phasenfluss nach den folgenden Parametern ein: Start des mobilen Phasenflusses (0-3 min): 100% A gefolgt von einem linearen Gradienten auf 10% A (3-25 min), endend mit einem isokratischen Durchfluss von 10% A bis 34 min, gefolgt von 6 min der Wiedergleichgewichtszeit der Säule. Verwenden Sie für die HILIC-Trennung eine HILIC-Säule (2,0 mm x 100 mm, 3 m, 200A). Stellen Sie den Durchfluss auf 400 l/min ein. Bereiten Sie mobile Phasen nach folgenden Proportionen vor: mobile Phase A: Acetonitril:Ammoniumacetatpuffer (9:1, v/v, effektive Salzkonzentration 20 mM), mobile Phase B: Acetonitril:Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v, effektive Salzkonzentration 20 mM). Stellen Sie den mobilen Phasenfluss nach den folgenden Parametern ein: Starten des mobilen Phasenflusses (0-3 min) auf 100% A, halten Sie 3,0 min und fahren Sie dann innerhalb von 5 min auf 100% B. Halten Sie mit 100% B bis 12 min, gefolgt von 8 min der Kolonnen-Wiedergleichgewichtszeit. Stellen Sie den Scanbereich auf 85-1000 m/z ein. HESI-Ionenquellenparameter im positiven Ionisationsmodus auf: Sprühspannung 1.500 V, Kapillartemperatur 300 °C, Mantelgas 40 n.V., Aux-Gasdurchfluss rate 15 n.V., Sondenheiztemperatur 300 °C, S-Lens HF-Pegel 55%. Führen Sie QC-Samples aus 10 L jeder analysierten Probe (regelmäßig alle 10-12 Samples) aus, um die Leistung des Instruments zu überwachen. Verwenden Sie für die umgekehrte Phasentrennung eine C18-Säule (2,1 mm x 75 mm, 3,5 m). Stellen Sie den Durchfluss auf 200 l/min und die Autosampler- und Säulentemperaturen auf 4 °C bzw. 55 °C ein. Vorbereiten mobiler Phasen nach folgenden Proportionen: mobile Phase A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM Essigsäure; mobile Phase B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM Essigsäure. Stellen Sie den mobilen Phasenstrom nach den folgenden Parametern ein: 0-1 min (20% B), 1-1.5 min (20-50% B), 1.5-7.5 min (50-70% B), 7.5 -13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17.1 min (95-20% B), 17.1-23 min (20%). Verwenden Sie für die HILIC-Trennung eine HILIC-Säule (100 x 2,1 mm, 3 m). Stellen Sie den Durchfluss auf 400 l/min und die Autosampler- und Säulentemperaturen auf 4 °C bzw. 40 °C ein. Vorbereiten mobiler Phasen nach folgenden Proportionen: Mobile Phase A: ACN; mobile Phase B: 5 mM Ammoniumacetat in Wasser. Stellen Sie den mobilen Phasenfluss nach den folgenden Parametern ein: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15.1 min (80-96% B), 15.1-21 min (96% B). HeSI-Ionenquellenparameter im positiven Ionisationsmodus auf Sprühspannung 3.500 V, Kapillartemperatur 275 °C, Mantelgas 20 n.V., Aux-Gasdurchfluss rate 10 n.V., Sondenheiztemperatur 300 °C, S-Lens HF-Pegel 55% einstellen. Führen Sie QC-Samples aus, die aus 10 l jeder analysierten Probe (alle 10-12 Samples) bestehen, um die Leistung des Instruments zu überwachen. Führen Sie die Datenerfassung in Software durch, die mit dem Gerät kompatibel ist. 6. Datenanalyse Führen Sie Datenverarbeitung, vermeintliche Identifizierung und statistische Analyse mit der Verwendung von Software für ungezielte Metabolomik und Lipidomik-Analyse.HINWEIS: Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Box-Whisker-Plots können abgerufen werden, um die Datenstruktur zu visualisieren.

Representative Results

Die Probenentnahme erfolgte nach dem oben beschriebenen SPME-Verfahren unter Verwendung von Sonden, die mit einer 7 mm gemischten Extraktionsphase beschichtet waren. Die Probenahme erfolgte direkt aus dem Transplantatgewebe (in vivo vor der Transplantation), ex vivo in der Nierenkammer nach 1 h, 3 h, 5 h und 7 h Perfusion und in vivo nach Revaskularisation beim Empfänger. Ungezielte metatonomische und lipidomische Analysen wurden mit der Verwendung von Flüssigchromatographie (RP, HILIC) in Verbindung mit hochauflösender Massenspektrometrie durchgeführt, wobei der Massenanalysator im positiven Ionisationsmodus eingestellt wurde. Um die Datenqualität zu bewerten und allgemeine Erkenntnisse über die Ergebnisse zu erhalten, wurden die Daten einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) unterzogen. Wie in Abbildung 1dargestellt, bildeten QC-Proben einen engen Cluster, der die Qualität der Analysen bestätigte. Die untersuchten Gruppen weisen eine relativ gute Trennung auf, die eine Visualisierung von Unterschieden in metabolischen und lipidomischen Profilen vor und nach der Transplantation sowie während der Organperfusion ermöglicht (Abbildung 2). SPME-Probenahme ermöglicht eine metabolische Profilierung des Organs im Laufe der Zeit. Box-Whisker-Plots ausgewählter Metaboliten dienen dazu, Veränderungen der Metabolitenwährend während des gesamten Experiments zu veranschaulichen (Abbildung 3). Das breite Spektrum der extrahierten Features, die sowohl in RP- als auch in HILIC-Spalten getrennt sind, ist in Abbildung 4dargestellt. Abbildung 1: Hauptkomponentenanalyse, die Clustering von Qualitätskontrollproben für metabolomische Umkehrphasen (A), HILIC (B) und lipidomische Umkehrphasen (C), HILIC (D) Analysen zeigt. Die Qualitätskontrolle ist bei der ungezielten Analyse notwendig, um mögliche Veränderungen zu überwachen, die durch eine instrumentelle Instabilität verursacht werden. Ein enger Cluster von QC-Proben stellt sicher, dass alle beobachteten Veränderungen biologischen Ursprungs sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Hauptkomponentenanalyse, die metabotomische (A) und lipidomische (B) Unterschiede zwischen bestimmten Probenahmepunkten zeigt. Das ungezielte Profilieren der Niere mit SPME-LC-HRMS ermöglicht es, biochemische Unterschiede in Organen bei späteren Konservierungsschritten zu beobachten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Box-Whisker-Plots ausgewählter Verbindungen, die Veränderungen in Metaboliten (A, B) und Lipiden (C, D) während der Peritransplantatphase zeigen. Nach der Auswahl und Identifizierung diskriminierender Verbindungen ermöglichen Box-Whisker-Plots, Veränderungen dieser Verbindungen bei nachfolgenden Schritten des Protokolls zu überwachen und die Metabolitenspiegel in Organen zu vergleichen, die unterschiedlichen Konservierungsprotokollen unterzogen oder von verschiedenen Spendern geerntet werden, z. B. herzschlagende Spender oder Spender nach dem Herztod. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Ionenkarte (m/z versus Retentionszeit) von Features, die durch LC-MS-Analyse mit (A) umgekehrter Phase und (B) HILIC-Trennung erhalten wurden. Das Diagramm ermöglicht es, die Gesamtzahl der mit dem vorgeschlagenen Protokoll erhaltenen Merkmale (von der Extraktion bis zur Detektion) zu schätzen und die Analytabdeckung auf der Grundlage der Polarität zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Bewertung der Organqualität bleibt eine große Herausforderung für Ärzte, die schnell informierte Entscheidungen darüber treffen müssen, ob ein bestimmtes Organ für eine Transplantation lebensfähig ist oder ob es verworfen werden muss. Mehrere Faktoren, wie Spenderalter, Dauer der Ischämie, und Infektionen und entzündliche Prozesse, können das langfristige Transplantatergebnis beeinflussen. Während bisher verschiedene Methoden zur Diagnose der Nierenallograft-Funktion entwickelt wurden, bleibt die histopathologische Inspektion der Goldstandard in dieser Angelegenheit3,4,12. Obwohl das Biopsieverfahren signifikante Informationen über bereits bestehende Spendererkrankungen und Gefäßveränderungen liefern kann, ist es nicht frei von Fehlern. Stichprobenfehler im Zusammenhang mit der Interobserver-Variabilität und der Probenahme unzureichender Glomeruli für umfassende Informationen über die Organfunktion bleiben in dieser Hinsicht typische Bedenken. Darüber hinaus bringt die Probenvorbereitung einige Fragen mit sich, wie z. B. eine unvollständige Beurteilung des Transplantats bei gefrorenen Abschnitten und die Verlängerung der Verfahrenszeit für Paraffinschnitte. Das erhöhte Blutungsrisiko, das akut als mikroskopische oder grobe Hämaturie auftreten kann, ist jedoch die größte lebensbedrohliche Komplikation im Zusammenhang mit dem Biopsieverfahren. Aus diesem Grund ist die Anzahl der zulässigen Biopsien in Transplantationsverfahren streng begrenzt, ein Faktor, der die Erfassung dynamischer Veränderungen und Zeitreihenanalysen mit dieser Methode behindert12,13,14. Die Vorteile einer histologischen Analyse müssen gegen die mit der Methodik verbundenen Risiken abgewogen werden. Der Wert histologischer Befunde ist unbestritten, aber sie erklären nicht die molekularen Mechanismen der Aberrationen.

Metabolomik und Lipidomik sind die jüngsten Bereiche der wissenschaftlichen Familie der “-omics”. Der komplette Satz niedermolekularer (<1.200 Da) menschlicher Metaboliten und Lipide, die innerhalb eines metabolischen Netzwerks verbunden sind, ist definiert als menschliches Metabolom. Das Genom bleibt während seiner gesamten Lebensdauer relativ konstant, wobei leichte Modifikationen durch selten auftretende Mutationen verursacht werden. Das Metabolom ist das Produkt der Genexpression, die sehr empfindlich auf Veränderungen in allen biologischen Prozessen sowie Umweltfaktoren reagiert. Die dynamische Natur von Metaboliten und Lipiden macht sie perfekte Indikatoren der aktuellen Organzustand7,8,15,16. Die im oben genannten Protokoll vorgeschlagene SPME-Methode ermöglicht den Nachweis von Veränderungen, die im Organ während seiner Erhaltung auftreten, angefangen bei der Organentfernung aus dem Körper des Spenders bis zur Revaskularisation beim Empfänger. Der kleine Durchmesser der Sonde (ca. 200 m) bietet minimale Invasivität und ermöglicht mehrere Proben vom selben Organ, ohne das Gewebe zu beschädigen. Die Durchführung von Studien mit Dernie, als das am häufigsten transplantierte Organ, ermöglicht ein besseres Verständnis und eine weitere Charakterisierung der Stoffwechselwege, die für die Qualitäts- und Funktionsfähigkeit von Transplantaten verantwortlich sind. Die Möglichkeit, Modifikationen im Laufe der Zeit zu überwachen, ist sicherlich ein wichtiger Vorteil der Technik im Vergleich zu konventionellen invasiven Methoden wie der Biopsie. Die derzeit vorgestellte Analyse identifizierte veränderte Konzentrationen verschiedener Gruppen von Lipiden und Metaboliten, insbesondere von essentiellen Aminosäuren, Purinen, Purinnukleosiden und Glycerophospholipiden. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Gewebeanalyseberichten5,6,17,18,19,20überein. Bis heute sind die meisten wissenschaftlichen Berichte, die Metabolomik oder Lipidomik verwenden, um Prozesse zu erklären, die Komplikationen nach der Transplantation oder Ischämie/Reperfusionsverletzung (IRI) verursachen, auf die Analyse von Biofluiden21,22,23beschränkt.

Jede klinische Anwendung erfordert eine Optimierung des Probenahmeprotokolls, um sicherzustellen, dass die Leistung der Analysemethode den erwarteten Kriterien entspricht. In diesem Zusammenhang besteht der Vorteil der Verwendung von SPME in der Möglichkeit, die Bedingungen für verschiedene Versuchsentwürfe anzupassen. Die Vielfalt der zugänglichen Extraktionsphasen bietet ein breites Spektrum extrahierter Metaboliten mit diversifizierten Polaritäten. Gleichzeitig könnte dies als Einschränkung des Verfahrens angesehen werden, da jedes Sorbens selektiv zu bestimmten Merkmalen bietet und nicht alle in der Probenmatrix vorhandenen Verbindungen extrahiert. Es sollte beachtet werden, dass SPME-Beschichtungen nur über freie Moleküle extrahieren und einfach nicht mit einem gebundenen Anteil des Analyten interagieren. Die Biokompatibilität der Beschichtungen führt nicht zu Toxizität für das Gewebe, während die Extraktion großer Moleküle wie Proteine zurückbleibt; Infolgedessen werden die enzymatischen Prozesse bereits im Stadium der Probenentnahme gehemmt und das Vorhandensein von Artefakten minimiert, was ein großer Vorteil gegenüber alternativen Probenahmemethoden ist. Die Länge der Beschichtung beeinflusst die Effizienz der Extraktion (d. h. die Länge der Beschichtung bezeichnet die Oberfläche und das Extraktionsphasenvolumen); Daher führen längere Beschichtungen zu höheren Rückgewinnungen. Auf der anderen Seite ermöglichen kürzere Beschichtungen eine höhere räumliche Auflösung. Für zuverlässige Ergebnisse ist es entscheidend, die Sonde auf die exakt gleiche Tiefe des Nierenkortex zu tauchen. Einzustecken zu tief verursacht das Risiko des Eintritts in die Niere Medulla. Die Zeit der Extraktion ist auch proportional zur Extraktionseffizienz. Daher ist die Auswahl der optimalen Extraktionszeit einer der wichtigsten Schritte in der Entwicklung der SPME-Methode. Die Genauigkeit der Zeitmessung bietet höchste Wiederholgenauigkeit. Bei biologischen Anwendungen wie der diskutierten gibt es immer einen Kompromiss zwischen der Empfindlichkeit und Wiederholbarkeit des Analyseprotokolls und den Einschränkungen des medizinischen Verfahrens. Während die Gleichgewichtsextraktion die höchste Empfindlichkeit bietet, werden aus Sicherheitsgründen häufig Vorgleichgewichtsbedingungen in solchen Anwendungen verwendet, da die Extraktionszeit die Gesamtdauer der Operation nicht beeinflussen sollte. Die Effizienz der Desorption wird durch den Zeitpunkt des Prozesses und die Zusammensetzung des Desorptionslösungsmittels bestimmt, das mit der mobilen Phase für die chromatographische Trennung9,10,11kompatibel sein sollte.

Eine der wichtigsten Anforderungen an diagnostische Instrumente, die für intrachirurgische Beurteilungen verwendet werden, ist die Zeit der Analyse. Derzeit wird versucht, ein schnelles Werkzeug für die in vivo SPME-Extraktion zu entwickeln, das direkt an ein Massenspektrometer gekoppelt ist, über die mikrofluidische offene Schnittstelle (MOI)24 oder das beschichtete Klingenspray (CBS)25. Solche Ansätze würden die Offenlegung von Analyseergebnissen in realer oder naher Echtzeit ermöglichen. Der Einsatz solcher Methoden für Vorinterventionsanalysen von metabolischen und lipidomischen Profilen könnte den Entscheidungsprozess während der Transplantationsverfahren verbessern und so den bestmöglichen personalisierten Ansatz und eine schnelle Reaktion im Falle eines Organversagens ermöglichen.

Zusammenfassend wird vermutet, dass das vorgeschlagene Protokoll die Erreichung vollständiger metabolischer und lipidomischer Profile von Nierentransplantaten ermöglichen wird, was wiederum eine umfassende Bewertung der Organqualität und Charakterisierung der Prozesse ermöglichen würde, die für Ischämie-Reperfusionsverletzungen verantwortlich sind. Die Neuheit des Projekts umfasst die Nutzung der Festphasen-Mikroextraktion (SPME), die eine niedriginvasive Probenahme von lebenden Systemen in Kombination mit einer der innovativsten Technologien für die Metabolomik- und Lipidomik-Analyse (z. B. das Orbitrap-Massenspektrometer mit hoher Auflösung) anbietet. SPME kombiniert die Probenentnahme, Extraktion und Abschreckung von Metaboliten in einem Schritt und ist somit ein perfektes Werkzeug für die schnelle Analyse. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll dazu beitragen wird, Fragen zu beantworten, welche Vortransplantationsbedingungen der Niere für die verzögerte Organfunktion oder ihre Funktionsstörungen nach der Transplantation verantwortlich sind, sowie darüber, wie das Transplantationserhaltungsprotokoll die Biochemie des Organs beeinflusst. Ein solches Wissen hätte nicht nur erhebliche Auswirkungen auf die Prävention möglicher Komplikationen im Zusammenhang mit Transplantationen, sondern könnte auch dazu beitragen, die aktuellen Transplantationskonservierungsprotokolle zu verbessern, den Verlust lebensfähigen Transplantationsgewebes sowie den Verlust von Leben zu minimieren. Die vorgeschlagene Lösung wird die Tür für weitere Untersuchungen in diesem Bereich öffnen, einschließlich der Validierung spezifischer potenzieller Biomarker und der Verbesserung der therapeutischen Ergebnisse in der Transplantologie.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Studie wurde durch das Stipendium Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 vom National Science Centre unterstützt. Die Autoren möchten MilliporeSigma, ein Unternehmen der Merck KGaA, Darmstadt, deutschlandfür die Bereitstellung von SPME-Geräten würdigen. Das Life-Science-Geschäft von Merck firmiert als MilliporeSigma in den USA und Kanada. Außerdem möchten die Autoren Thermo Fisher Scientific für den Zugang zum Q-Exactive Focus Orbitrap-Massenspektrometer danken. Die Autoren danken Dr. Aleksandra Woderska-Jasiska und dem Personal der Abteilung für Transplantations- und Allgemeinchirurgie in Bydgoszcz für ihre freundliche Unterstützung bei dem Projekt. BB möchte Prof. Janusz Pawliszyn für die Möglichkeit der Probenentnahme im Toronto General Hospital während ihres Aufenthalts an der University of Waterloo danken.

Materials

Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column
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参考文献

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Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).
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