使用化学活检进行移植质量评估

所有动物都得到人道关怀，符合国家医学研究学会制定的”实验室动物护理原则”和加拿大安大略省国家卫生研究所发布的《实验室动物护理指南》。多伦多综合研究所动物护理委员会批准了所有研究。这项研究涉及人类主体，在托伦的比德戈什茨·尼古拉·哥白尼大学医学学院的生物伦理学委员会批准了这项研究。 注：获得相应道德委员会的批准。记得永远戴安全手套。请勿触摸 SPME 探头的提取阶段。建议使用停用的玻璃小瓶进行唇部分析。 1. 准备探头 准备涂有 7 mm 混合模式吸附剂的钛镍合金探头（40 毫米长;直径 0.2 mm）。探测数量取决于整个过程中的目标时间点和复制数（建议每个时间点 3 个）。注：可根据研究模式、代谢物极性、样品基质等调整提取阶段的长度和类型。 准备由2：1氯仿：甲醇（v/v）组成的清洁混合物。将溶液的1.0 mL移至每个2.0 mL玻璃瓶，并放置一个探头，以前通过瓶盖刺穿，在每个小瓶中。注：使用前，请清洁所有探头以清除污染颗粒。 将小瓶放在搅拌器上，将搅拌速度设置为 1，200 rpm。45 分钟后，停止设备，用 LC-MS 级水冲洗涂层。 由于涂料必须经过预处理步骤才能激活它们，因此准备由 1：1 甲醇：水（v/v）组成的预置混合物。将溶液的1.0 mL移至每个2.0 mL玻璃瓶，并放置一个探头，以前通过瓶盖刺穿，在每个小瓶中。 将小瓶放在涡流搅拌器上，将搅拌速度设置为 1，200 rpm。 60 分钟后，停止搅拌器，用 LC-MS 级水冲洗涂层。 根据标准手术设备灭菌方案对探头进行灭菌。 2. 提取 在取样前打开无菌包装，以确保无菌环境。 在每个时间点将两个探针直接插入肾脏皮层 10 分钟。涂层的整个长度必须由组织基体覆盖;不需要特定角度，但通常使用约 90 度。注：整个医疗程序遵循给定机构的标准规程。不考虑修改有关 SPME 采样。该过程涉及以下六个采样时间点：a） 肾切除前，由供体在体内;b）-e） 1小时、3小时、5小时、7小时肾灌注、器官室外体;f） 再灌注后，从接受者体内。 将探针从组织中拉出，然后用 LC-MS 级水冲洗涂层，以清除涂层表面剩余的血液。冲洗远离手术现场，并立即删除探头。 3. 运输和储存 将探头放在单独的小瓶中并关闭它们。 将小瓶放在装满干冰的发泡胶盒中或液氮中运输。 将样品存放在冰柜 （-80 °C） 中，或立即开始脱吸步骤。 4. 脱吸 准备由80：20乙酰胺：水（v/v）组成的脱吸溶液进行代谢分析，1：1异丙醇：甲醇（v/v）用于脂肪分析。 管道100μL溶液插入放入2.0 mL标签小瓶，并放置一个探头，以前刺穿盖，在每个小瓶。 将小瓶放在涡流搅拌器上，将搅拌速度设置为 1，200 rpm，持续 120 分钟。 从小瓶中拆下探头。获取的提取现已准备好进行工具分析。 5. LC-MS 分析 将含有提取物的小瓶放在 LC-MS 系统的自动采样器中。注：本研究采用液相色谱（RP、HILIC）和高分辨率质谱仪和轨道rap质量分析仪。有关代谢分析参数，请转到步骤 5.2。有关唇部分析参数，请转到步骤 5.6。 使用五氟苯基 （PFP） 列（2.1 毫米 x 100 毫米，3 μm）进行反相分离。 将流速设置为 300 μL/min，自动采样器和柱温度分别设置为 4 °C 和 25 °C。 根据以下比例准备移动相：移动阶段 A：水：甲酸（99.9：0.1，v/v）和移动相 B：乙酰三叶酸：甲酸（99.9：0.1，v/v）。根据以下参数设置移动相流：启动移动相流（0-3分钟）：100% A，然后是线性梯度至 10% A（3-25 分钟），以 10% A 至 34 分钟不等的等式流，然后是 6 分钟的柱重新平衡时间。 对于 HILIC 分离，请使用 HILIC 柱（2.0 毫米 x 100 毫米、3 μm、200A）。将流速设置为 400 μL/min。 根据以下比例准备移动相：移动阶段A：醋酸铵缓冲液（9：1，v/v，有效盐浓度20 mM），移动阶段B：乙酰三酯：醋酸铵缓冲液（1：1，v/v，有效盐浓度20 mM）。 根据以下参数设置移动相流：以 100% A 启动移动相流（0-3 分钟），保持 3.0 分钟，然后在 5 分钟内向 100% B 移动。保持 100% B 直到 12 分钟，然后是 8 分钟的柱重新平衡时间。 将扫描范围设置为 85-1000 m/z。将 HESI 离子源参数设置为正电离模式：喷压电压 1，500 V，毛细管温度 300 °C，护套气体 40 a.u.，辅助气体流速 15 a.u.，探头加热器温度 300 °C，S-Lens RF 级别 55%。 运行由每个分析样品的 10 μL（定期，每 10-12 个样本）组成的 QC 样品，以监控仪器性能。 对于反向相位分离，请使用 C18 柱（2.1 毫米 x 75 毫米，3.5 μm）。 将流速设置为 200 μL/min，自动采样器和柱温度分别设置为 4 °C 和 55 °C。根据以下比例准备移动相：移动阶段：H2O：MeOH（60：40，v/v），10 mM醋酸铵和1 mM醋酸;移动阶段B：IPA：MeOH（90：10，v/v），10 mM醋酸铵和1mM醋酸。 根据以下参数设置移动相流：0-1 分钟（20% B）、1-1.5 分钟（20-50% B）、1.5-7.5 分钟（50-70% B）、7.5 13分钟（70-95%B），13-17分钟（95%B），17-17.1分钟（95-20%B），17.1-23分钟（20%）。 对于 HILIC 分离，请使用 HILIC 列（100 x 2.1 mm，3 μm）。 将流速设置为 400 μL/min，自动采样器和柱形温度分别设置为 4 °C 和 40 °C。 按照以下比例准备移动阶段：移动阶段 A：ACN;移动阶段B：水中5mM醋酸铵。根据以下参数设置移动相流：0-2 分钟（96% B）、2-15 分钟（96-80% B）、15-15.1 分钟（80-96% B）、15.1-21 分钟（96% B）。 设置正电离模式下的 HESI 离子源参数，喷电压 3，500 V，毛细管温度 275 °C，护套气体 20 a.u.，辅助气体流速 10 a.u.，探头加热器温度 300 °C，S-Lens RF 级别 55%。 运行由每个分析样品（每 10-12 个样本）的 10 μL 组成的 QC 样品，以监控仪器性能。 在与仪器兼容的软件中执行数据采集。 6. 数据分析 使用专用于非目标代谢组学和唇部分析的软件，执行数据处理、预测识别和统计分析。注：可以获取主要组件分析 （PCA） 和盒式图形图，以可视化数据结构。