이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용

모든 동물은 국립 의학 연구 학회가 공식화한 ‘실험실 동물 관리의 원리’와 캐나다 온타리오 주 국립 보건연구소가 발표한 ‘실험실 동물 관리를 위한 가이드’에 따라 인도적인 치료를 받았습니다. 토론토 일반 연구소의 동물 관리 위원회는 모든 연구를 승인했습니다. 연구 관련 된 인간의 과목 은 토룬에서 Bydgoszcz 니콜라우스 코페르니쿠스 대학에 있는 Collegium Medicum에 생물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다. 참고: 적절한 윤리 위원회의 승인을 받으세요. 항상 안전 장갑을 착용해야합니다. SPME 프로브의 추출 단계를 만지지 마십시오. 비활성화 된 유리 바이알의 사용은 리피도믹 분석에 권장됩니다. 1. 프로브 준비 7mm 믹스 모드 소벤트로 코팅된 티타늄-니켈 합금 프로브(길이 40mm, 직경 0.2mm)를 준비합니다. 프로브 수는 전체 절차 중에 타겟팅된 시간 점과 복제 횟수(시간당 3개 권장)에 따라 달라집니다.참고: 추출 단계의 길이 및 유형은 연구 모드, 대사 산물의 극성 및 샘플 매트릭스에 따라 조정될 수 있다. 2:1 클로로폼:메탄올(v/v)으로 구성된 세정 혼합물을 준비한다. Pipet 1.0 mL of the solution to each 2.0 mL glass vial and place one probe, previously pierced through the cap, in each vial.참고: 사용하기 전에 모든 프로브를 청소하여 오염 입자를 제거합니다. 교반기위에 바이알을 놓고 교반 속도를 1,200 rpm으로 설정합니다. 45분 후 장치를 멈추고 LC-MS 급수로 코팅을 헹구십시오. 코팅은 이를 활성화하기 위해 사전 조절 단계를 거쳐야 하므로 1:1 메탄올:물(v/v)으로 구성된 사전 조절 혼합물을 준비한다. Pipet 1.0 mL of the solution to each 2.0 mL glass vial and place one probe, previously pierced through the cap, in each vial. 소용돌이 교반기에 바이알을 넣고 교반 속도를 1,200 rpm에서 설정합니다. 60분 후 교반기는 멈추고 LC-MS 급수로 코팅을 헹구십시오. 표준 외과 장비 살균 프로토콜에 따라 프로브를 살균합니다. 2. 추출 멸균 환경을 보장하기 위해 샘플링 직전에 멸균 패키지를 엽니다. 각 시점에서 10 분 동안 신장 피질에 직접 두 개의 프로브를 삽입합니다. 코팅의 전체 길이는 조직 매트릭스에 의해 가려져야한다; 특정 각도는 필요하지 않지만 ca. 90 deg는 일반적으로 사용됩니다.참고: 전체 의료 절차는 지정된 기관의 표준 프로토콜을 따릅니다. SPME 샘플링에 대한 수정은 고려되지 않습니다. 절차는 다음 여섯 샘플링 시간 점을 포함한다:a) 신장 절제술 전에, 기증자로부터 생체 내에서;b)-e) 후 1 h, 3 h, 5 h, 7 h 신장 관류, 장기 챔버에서 전 생체;f) 레퍼퓨전 후, 수신자로부터 생체 내. 조직에서 프로브를 꺼내서 프로브를 철회한 다음 LC-MS 등급의 물로 코팅을 헹구어 코팅 표면에서 남은 혈액을 제거합니다. 수술 부위에서 멀리 헹구고, 프로브를 제거한 직후에 헹구는 다. 3. 운송 및 저장 프로브를 별도의 바이알에 놓고 닫습니다. 유리병을 드라이 아이스로 가득 차거나 액체 질소로 채워진 스티로폼 상자에 놓아 운반합니다. 샘플을 냉동고(-80°C)에 저장하거나 즉시 탈착 단계를 시작합니다. 4. 탈착 메타볼로믹 분석을 위한 80:20 아세토니일:물(v/v)과 1:1 이소프로판올:메탄올(v/v)으로 구성된 탈색 용액을 준비하여 리피도믹 분석을 위한 다정압을 준비한다. 용액의 파이프 100 μL은 2.0mL에 삽입하여 라벨이 부착된 바이알에 배치하고 이전에 각 유리병에 캡을 관통한 프로브 1개를 배치합니다. 소용돌이 교반기에 바이알을 넣고 120 분 동안 1,200 rpm에서 교반 속도를 설정합니다. 바이알에서 프로브를 제거합니다. 획득한 추출물은 이제 기악 분석에 대한 준비가 되었습니다. 5. LC-MS 분석 LC-MS 시스템의 자동 샘플러에 추출물이 포함된 바이알을 배치합니다.참고: 액체 크로마토그래피(RP, HILIC)와 고해상도 질량 분석기 및 궤도랩 질량 분석기와 결합하여 이 연구를 위해 사용되었습니다. 메타볼로믹 분석 매개 변수의 경우 5.2 단계로 이동하십시오. lipidomic 분석 매개 변수의 경우 5.6 단계로 이동하십시오. 펜타플루오로페닐(PFP) 컬럼(2.1mm x 100mm, 3 μm)을 사용하여 상 분리를 반전시라. 유량을 각각 300 μL/min, 자동 샘플러 및 기둥 온도를 4°C 및 25°C로 설정합니다. 다음 비율에 따라 이동 상 준비: 물: 포믹 산 (99.9:0.1, v/v), 및 이동 단계 B: 아세토닐:포믹 산 (99.9:0.1, v/v). 다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 이동 상 흐름 시작 (0-3 분): 100% A 는 10% A (3-25 분)에 선형 그라데이션 다음, 34 분까지 10 % A의 등도 흐름으로 끝나는, 열 재평시간의 6 분. HILIC 분리의 경우 HILIC 컬럼(2.0mm x 100mm, 3 μm, 200A)을 사용하십시오. 유량을 400 μL/min으로 설정합니다. 다음 비율에 따라 이동 상 준비: 아세토닐트릴:암모늄 아세테이트 버퍼 (9:1, v/v, 유효 소금 농도 20 mM), 이동 단계 B: 아세토닐레:암모늄 아세테이트 버퍼 (1:1, v/v, 효과적인 소금 농도 20 mM). 다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 모바일 위상 흐름 시작 (0-3 분) 100% A에서, 3.0 분 동안 유지 한 다음 5 분 이내에 100 % B로 램프. 12분까지 100% B로 잡고, 8분 동안 열평형 시간을 갖는다. 스캔 범위를 85-1000 m/z로 설정합니다. 푸티지 이온화 모드에서 HESI 이온 소스 파라미터를 설정: 스프레이 전압 1,500 V, 모세관 온도 300°C, 칼집 가스 40 a.u., 보조 가스 유량 15 a.u., 프로브 히터 온도 300°C, S-렌즈 RF 레벨 55%. 각 분석된 샘플(정기적으로 10-12개의 샘플마다)의 10μL로 구성된 QC 샘플을 실행하여 계측기 성능을 모니터링합니다. 반전 된 위상 분리의 경우 C18 컬럼 (2.1 mm x 75mm, 3.5 μm)을 사용합니다. 유량을 각각 200 μL/min, 자동 샘플러 및 기둥 온도를 4°C 및 55°C로 설정합니다. 다음 비율에 따라 이동 단계 준비: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산; 이동상 B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산. 다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 0-1 분 (20% B), 1-1.5 분 (20-50% B), 1.5-7.5 분 (50-70% B), 7.5 -13분(70~95% B), 13-17분(95% B), 17-17.1분(95~20% B), 17.1~23분(20%). HILIC 분리의 경우 HILIC 컬럼(100 x 2.1 mm, 3 μm)을 사용합니다. 유량을 각각 400 μL/min, 자동 샘플러 및 기둥 온도를 4°C 및 40°C로 설정합니다. 모바일 단계 A: ACN; 이동상 B: 물에 5mM 암모늄 아세테이트. 다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 0-2 분 (96% B), 2-15 분 (96-80% B), 15-15.1 분 (80-96% B), 15.1-21 분 (96% B). HESI 이온 소스 파라미터를 전압 3,500V, 모세관 온도 275°C, 칼집 가스 20a.u., 보조 가스 유량 10a.u., 프로브 히터 온도 300°C, S-렌즈 RF 레벨 55%를 분사하도록 양수 이온화 모드에서 HESI 이온 소스 파라미터를 설정합니다. 각 분석된 샘플(매 10-12개의 샘플)의 10μL로 구성된 QC 샘플을 실행하여 계측기 성능을 모니터링합니다. 계측기와 호환되는 소프트웨어에서 데이터 수집을 수행합니다. 6. 데이터 분석 표적화된 메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석에 전념하는 소프트웨어를 사용하여 데이터 처리, putative 식별 및 통계 분석을 수행합니다.참고: 데이터 구조를 시각화하기 위해 주 성분 분석(PCA) 및 박스 수염 플롯을 얻을 수 있습니다.