JoVE Journal > Medicine
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Met behulp van een chemische biopsie voor Graft Quality Assessment

Published: June 17, 2020
doi:
10.3791/60946
, , , , , , , , ,
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy,Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery,Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz,Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4医学部,Toronto General Hospital

概要

Het protocol presenteert het gebruik van de chemische biopsie aanpak gevolgd door uitgebreide metabolomic en lipidomische analyse voor de kwaliteit van de beoordeling van niertransplantaties toegewezen voor transplantatie.

Abstract

Niertransplantatie is een levensreddende behandeling voor een groot aantal mensen met een eindstadium nierdisfunctie wereldwijd. De procedure wordt geassocieerd met een verhoogde overlevingskans en een grotere kwaliteit van het leven van de patiënt in vergelijking met conventionele dialyse. Helaas lijdt de transplantatieologie aan een gebrek aan betrouwbare methoden voor de beoordeling van de orgaankwaliteit. Standaard diagnostische technieken zijn beperkt tot macroscopische verschijning inspectie of invasieve weefselbiopsie, die geen uitgebreide informatie over de graft. Het voorgestelde protocol heeft tot doel vaste fasemicroextractie (SPME) in te voeren als een ideale analysemethode voor uitgebreide metabolomics en lipidomische analyse van alle laagmoleculaire verbindingen die aanwezig zijn in nieren die voor transplantatie zijn toegewezen. De kleine omvang van de SPME-sonde maakt de uitvoering van een chemische biopsie mogelijk, waardoor metabolieten rechtstreeks uit het orgaan kunnen worden verwijderd zonder dat er weefsel wordt verzameld. De minimale invasieve werking van de methode maakt het mogelijk om meerdere analyses in de loop van de tijd uit te voeren: direct na het oogsten van organen, tijdens het behoud ervan en onmiddellijk na revascularisatie op het lichaam van de ontvanger. Het wordt verondersteld dat de combinatie van deze nieuwe bemonsteringsmethode met een massaspectrometer met hoge resolutie discriminatie mogelijk zal maken van een reeks karakteristieke verbindingen die kunnen dienen als biologische markers van graftkwaliteit en indicatoren van mogelijke ontwikkeling van orgaandisfunctie.

Introduction

Volgens het United States’ Organ Procurement and Transplantation Network waren er in 2019 94.756 patiënten die in de VS op niertransplantaties wachtten; in Europa in 2018 waren dat er 10.791. Elke tien minuten, iemand wordt toegevoegd aan de nationale transplantatie wachtlijst in de VS, en er wordt geschat dat 20 mensen sterven elke dag te wachten op eentransplantatie 1,2. Niertransplantatie is een levensreddende behandeling voor een groot aantal mensen die lijden aan eindstadium nierdisfunctie wereldwijd. De procedure wordt geassocieerd met een verhoogde overlevingskans en een grotere kwaliteit van leven in vergelijking met conventionele dialyse.

Transplantatie kampt echter met veel ernstige problemen, zoals een tekort aan organen of het ontbreken van effectieve instrumenten voor de beoordeling van de orgaankwaliteit. De standaardprotocollen zijn beperkt tot macroscopische verschijningsinspectie of invasieve weefselbiopsie, die geen uitgebreide informatie geven over de kwaliteit van het transplantaat. Terwijl een visuele beoordeling zorgt voor identificatie van tumoren zichtbaar voor het oog, anatomische afwijkingen, of uitgebreide schade aan de grafts, deze aanpak is zeer subjectief, variërend in de effectiviteit ervan volgens de ervaring van de waarnemers. Biopsie, aan de andere kant, kan waardevolle informatie over reeds bestaande nieraandoeningen, en wordt dus beschouwd als een methode van objectieve en bewezen waarde bij het bepalen van graft resultaten. Echter, de biopsie procedure is niet vrij van gebreken; er is het risico van mogelijke complicaties zoals bloeden en een extra 4-5 uur monstervoorbereiding is vereist, wat de koude ischemische tijd aanzienlijk verlengt. Daarom is vooral in Europa het gebruik van directe weefselanalyse beperkt tot uitgebreide criteria donoren (ECD) en donoren na het overlijden van de bloedsomloop (DCD)3,4.

Metabolomics en lipidomics zijn onlangs erkend als veelbelovende benaderingen voor het bereiken van een beter begrip van de veranderingen in biochemische trajecten die zich voordoen tijdens orgaanbehoud. Metabolomic en lipidomic profilering maakt het mogelijk om onmiddellijke reacties van het systeem op plotselinge veranderingen in het milieu in verband met orgaanverwijdering met latere gevolgen: ischemie, oxidatieve stress of ontstekingsreacties5,6,7,8. De nier is een orgaan dat grotendeels wordt geassocieerd met metabole processen, dus metingen van metabolieten en lipiden concentraties kunnen het mogelijk maken identificatie van potentiële orgaankwaliteit biomarkers en maken betere voorspellingen van graft resultaat.

Gezien de bovenstaande complicaties en beperkingen in verband met de huidige orgaankwaliteitsbeoordelingsmethoden, is een minder invasieve diagnostische oplossing nodig voor een snelle en complexe orgaankwaliteitsbeoordeling. Solid phase microextraction (SPME) voldoet aan deze eisen als een minimaal invasieve analytische methode die dekking van een breed spectrum van metabolieten en lipiden mogelijk maakt. De techniek is gebaseerd op het inbrengen van een dunne (~ 200 μm), biocompatibele, titanium-nikkel legering sonde bedekt met een selectieve extractie fase in het onderzochte orgaan voor een korte tijd. Er moet worden benadrukt dat SPME eiwitextractie voorkomt en dus al in het stadium van de monsterverzameling een metabolismeremming mogelijk maakt, wat een aanzienlijk voordeel is ten opzichte van alternatieve methoden. Bovendien maakt de miniaturisatie van het apparaat het mogelijk om repetitieve en gelijktijdige analyses uit te voeren van enkele structuren van het orgel9,10,11.

Protocol

Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de ”Principles of Laboratory Animal Care” geformuleerd door de National Society for Medical Research en de ”Guide for the Care of Laboratory Animals” gepubliceerd door het National Institute of Health, Ontario, Canada. De Animal Care Committee van de Toronto General Research Institute goedgekeurd alle studies. Het onderzoek waarbij menselijke proefpersonen betrokken waren, werd goedgekeurd door het Bioethisch Comité van Collegium Medicum in Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University in Torun. LET OP: Verkrijg goedkeuring van de juiste ethische borden. Vergeet niet om altijd veiligheidshandschoenen te dragen. Raak de extractiefase van SPME-sondes niet aan. Het gebruik van gedeactiveerde glazen flacons wordt aanbevolen voor lipidomische analyses. 1. Voorbereiding van sondes Bereid de sondes van de legering van titanium en nikkel (40 mm lengte; 0,2 mm diameter) met 7 mm sorbent in de mengmodus. Het aantal sondes is afhankelijk van de tijdstippen die tijdens de hele procedure zijn gericht en het aantal replica’s (3 wordt aanbevolen per tijdpunt).OPMERKING: De lengte en het type extractiefase kunnen worden aangepast op basis van de wijze van studie, de polariteit van metabolieten en de monstermatrix. Bereid een reinigingsmengsel bestaande uit 2:1 chloroform:methanol (v/v). Pipet 1.0 mL van de oplossing voor elke 2,0 mL glazen flacon en plaats een sonde, eerder doorboord door de dop, in elke flacon.OPMERKING: Reinig voor gebruik alle sondes om vervuilende deeltjes te verwijderen. Zet de flacons op de roerganger en zet de agitatiesnelheid op 1.200 rpm. Na 45 minuten stopt u het apparaat en spoel de coatings af met water van LC-MS-kwaliteit. Aangezien coatings een voorconditionerende stap moeten ondergaan om ze te activeren, bereidt u een conditioneringsmengsel dat bestaat uit 1:1 methanol:water (v/v). Pipet 1.0 mL van de oplossing voor elke 2,0 mL glazen flacon en plaats een sonde, eerder doorboord door de dop, in elke flacon. Zet de flacons op de vortex agitator en zet de agitatie snelheid op 1.200 rpm. Na 60 min, stop de roerganger en spoel de coatings met LC-MS grade water. Steriliseren sondes volgens de standaard chirurgische apparatuur sterilisatie protocol. 2. Extractie Open de steriele verpakking vlak voor de bemonstering om een steriele omgeving te garanderen. Steek twee sondes direct in de nierschors gedurende 10 minuten op elk tijdstip. De volledige lengte van de coating moet door de weefselmatrix worden afgedekt; er is geen specifieke hoek nodig, maar meestal wordt ca. 90 deg gebruikt.LET OP: De volledige medische procedure volgt standaardprotocollen in bepaalde instelling. Er wordt geen wijziging met betrekking tot spme-bemonstering overwogen. De procedure omvat de zes volgende bemonsteringstijdpunten:a) vóór de resectie van de nieren, in vivo van donor;b)-e) na 1 uur, 3 uur, 5 uur, 7 uur nierperfusie, ex vivo in orgaankamer;f) na reperfusie, in vivo van de ontvanger. Trek de sondes in door het uit het weefsel te trekken en spoel vervolgens coatings met LC-MS-kwaliteit water om het resterende bloed van het coatingoppervlak te halen. Spoel weg van de chirurgische plaats, en onmiddellijk na verwijdering van de sondes. 3. Vervoer en opslag Plaats sondes in aparte flesjes en sluit ze. Plaats flesjes in een piepschuim doos gevuld met droog ijs of in vloeibare stikstof voor transport. Bewaar monsters in een vriezer (-80 °C), of onmiddellijk beginnen met de desorptie stap. 4. Desorptie Bereid desorptieoplossingen voor bestaande uit 80:20 acetonitril:water (v/v) voor metabolomic analyse en 1:1 isopropanol:methanol (v/v) voor lipidomische analyse. Pipet 100 μL van de oplossing voor inserts geplaatst in 2,0 mL gelabelde flesjes en plaats een sonde, eerder doorboord door de dop, in elke flacon. Zet de flacons op de vortex agitator en zet de agitatie snelheid op 1.200 rpm voor 120 min. Verwijder sondes uit de flesjes. Verkregen extracten zijn nu klaar voor instrumentele analyse. 5. LC-MS analyse Plaats flacons met extracten in de autosampler van het LC-MS systeem.OPMERKING: Vloeibare chromatografie (RP, HILIC) in combinatie met hoge resolutie massaspectrometrie en een orbitrap massa analyzer werden gebruikt voor deze studie. Voor metabolomic analyse parameters, ga naar stap 5.2. Voor lipidomic analyse parameters, ga naar stap 5.6. Gebruik een pentafluorophenyl (PFP) kolom (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) voor omgekeerde fasescheiding. Stel de stroomsnelheid in op 300 μL/min en de temperatuur van de automatische versterker en kolom op respectievelijk 4 °C en 25 °C. Bereid mobiele fasen voor volgens de volgende verhoudingen: mobiele fase A: water:mierenzuur (99.9:0.1, v/v) en mobiele fase B: acetonitril:mierenzuur (99.9:0.1, v/v). Stel de mobiele fasestroom in volgens de volgende parameters: start van de mobiele fasestroom (0-3 min): 100% A gevolgd door een lineair verloop naar 10% A (3-25 min), eindigend met isocratische stroom van 10% A tot 34 min, gevolgd door 6 minuten kolomre-evenwichtstijd. Gebruik voor HILIC-scheiding een HILIC-kolom (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Stel de stroomsnelheid in op 400 μL/min. Bereid mobiele fasen voor volgens de volgende verhoudingen: mobiele fase A: acetonitril:ammoniumacetaatbuffer (9:1, v/v, effectieve zoutconcentratie 20 mM), mobiele fase B: acetonitrile:ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v, effectieve zoutconcentratie 20 mM). Stel de mobiele fasestroom in volgens de volgende parameters: start de mobiele fasestroom (0-3 min) op 100% A, houd 3,0 min vast en raap vervolgens binnen 5 minuten op naar 100% B. Houd met 100% B tot 12 min, gevolgd door 8 min kolom re-evenwicht tijd. Stel het scanbereik in op 85-1000 m/z. Stel HESI ionenbronparameters in positieve ionisatiemodus in op: sproeispanning 1.500 V, capillaire temperatuur 300 °C, schedegas 40 a.u., aux gas flow rate 15 a.u., probe heater temperature 300 °C, S-Lens RF level 55%. Voer QC-monsters uit die bestaan uit 10 μL van elk geanalyseerd monster (regelmatig, elke 10-12 monsters) om de prestaties van het instrument te controleren. Gebruik voor omgekeerde fasescheiding een C18-kolom (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm). Stel de stroomsnelheid in op 200 μL/min en de temperatuur van de automatische versterker en kolom op respectievelijk 4 °C en 55 °C. Bereid mobiele fasen voor volgens de volgende verhoudingen: mobiele fase A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM ammoniumacetaat en 1 mM azijnzuur; mobiele fase B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM ammoniumacetaat en 1 mM azijnzuur. Stel de mobiele fasestroom in volgens de volgende parameters: 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,55-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17,1 min (95-20% B), 17,1-23 min (20%). Gebruik voor HILIC-scheiding een HILIC-kolom (100 x 2,1 mm, 3 μm). Stel de stroomsnelheid in op 400 μL/min en de temperatuur van de automatische versterker en kolom op respectievelijk 4 °C en 40 °C. Bereid mobiele fasen voor volgens de volgende verhoudingen: mobiele fase A: ACN; mobiele fase B: 5 mM ammoniumacetaat in water. Stel de mobiele fasestroom in volgens de volgende parameters: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B). Stel HESI ionenbronparameters in positieve ionisatiemodus in op sprayspanning 3.500 V, capillaire temperatuur 275 °C, schedegas 20 a.u., aux gas flow rate 10 a.u., probe heater temperatuur 300 °C, S-Lens RF niveau 55%. Voer QC-monsters uit die bestaan uit 10 μL van elk geanalyseerd monster (elke 10-12 monsters) om de prestaties van het instrument te controleren. Gegevensverwerving uitvoeren in software die compatibel is met het instrument. 6. Gegevensanalyse Voer gegevensverwerking, vermeende identificatie en statistische analyse uit met behulp van software die is gewijd aan ongerichte metabolomics en lipidomics-analyse.OPMERKING: De belangrijkste componentenanalyse (PCA) en box-whisker plots kunnen worden verkregen om de gegevensstructuur te visualiseren.

Representative Results

De monsterverzameling werd uitgevoerd volgens de hierboven beschreven SPME-methode, met behulp van sondes die zijn bekleed met een extractiefase in gemengde modus van 7 mm. De bemonstering werd rechtstreeks uitgevoerd vanuit het transplantaatweefsel (in vivo vóór transplantatie), ex vivo in de nierkamer na 1 uur, 3 uur, 5 uur en 7 uur perfusie, en in vivo na revascularisatie bij de ontvanger. Ongerichte metabolische en lipidomische analyses werden uitgevoerd met het gebruik van vloeibare chromatografie (RP, HILIC) in combinatie met hoge resolutie massaspectrometrie, met de massaanalysator in positieve ionisatiemodus. Om de kwaliteit van de gegevens te beoordelen en algemene inzichten te verkrijgen met betrekking tot de resultaten, werden de gegevens onderworpen aan principal component analysis (PCA). Zoals blijkt uit figuur 1,vormden QC-monsters een strak cluster, wat de kwaliteit van de analyses bevestigde. De bestudeerde groepen vertonen een relatief goede scheiding, waardoor de verschillen in metabole en lipidomische profielen voor en na transplantatie kunnen worden gevisualiseerd, evenals tijdens orgaanperfusie(figuur 2). SPME-bemonstering maakt metabolische profilering van het orgaan na verloop van tijd mogelijk. Box-whisker percelen van geselecteerde metabolieten dienen om veranderingen in metaboliet niveaus te illustreren gedurende het hele experiment (Figuur 3). Het brede spectrum van geëxtraheerde kenmerken gescheiden op zowel RP- als HILIC-kolommen wordt weergegeven in figuur 4. Figuur 1: Principal component analyse met clustering van kwaliteitscontrole monsters voor metabolomic reversed-fase (A), HILIC (B) en lipidomic reversed-phase (C), HILIC (D) analyses. De kwaliteitscontrole is noodzakelijk in ongerichte analyse om eventuele veranderingen veroorzaakt door instrumentele instabiliteit te controleren. Strakke cluster van QC monsters zorgt ervoor dat alle waargenomen veranderingen van biologische oorsprong zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Hoofdcomponentanalyse waaruit metabolomic (A) en lipidomische (B) verschillen tussen bepaalde bemonsteringspunten blijkt. Ongerichte profilering van nieren met SPME-LC-HRMS maakt het mogelijk om biochemische verschillen in organen te observeren in latere stappen van hun bewaring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Box-whisker percelen van geselecteerde verbindingen met veranderingen in metabolieten (A, B) en lipiden (C, D) tijdens de peritransplantperiode. Na de selectie en identificatie van discriminerende verbindingen box-snorharen percelen maakt het mogelijk om veranderingen in de niveaus van deze verbindingen te controleren in latere stappen van het protocol en vergelijk de metabolieten niveaus in organen onderworpen aan verschillende behoud protocollen of geoogst van verschillende donoren bijvoorbeeld hartkloteren donoren of donoren na hartdood. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: Ionenkaart (m/z versus retentietijd) van functies verkregen door LC-MS analyse met (A) omgekeerde fase en (B) HILIC scheiding. Het perceel maakt het mogelijk om het totale aantal functies verkregen met het voorgestelde protocol (van extractie tot detectie) te schatten en analytdekking te beoordelen op basis van de polariteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Evaluatie van de orgaankwaliteit blijft een grote uitdaging voor artsen, die snel geïnformeerde beslissingen moeten nemen over de vraag of een bepaald orgaan levensvatbaar is voor transplantatie of dat het moet worden weggegooid. Meerdere factoren, zoals donorleeftijd, duur van ischemie en infecties en ontstekingsprocessen, kunnen de uiteindelijke uitkomst van de enting op lange termijn beïnvloeden. Hoewel tot op heden diverse methoden zijn ontwikkeld om de nieraltograftfunctie te diagnosticeren, blijft histopathologische inspectie de gouden standaard in die kwestie3,4,12. Hoewel de biopsieprocedure aanzienlijke informatie kan opleveren over reeds bestaande donorziekte en vasculaire veranderingen, is het niet vrij van gebreken. Bemonsteringsfouten in verband met interobservervariabiliteit en bemonstering van onvoldoende glomeruli voor uitgebreide informatie over de orgaanfunctie blijven in dit verband typische zorgen. Bovendien brengt de bereiding van specimen een aantal kwesties met zich mee, zoals een onvolledige beoordeling van het transplantaat in geval van bevroren delen, en verlenging van de proceduretijd voor paraffinesectie. Het verhoogde risico op bloedingen, die acuut kan lijken als microscopisch of grove hematurie, is echter de belangrijkste levensbedreigende complicatie die verband houdt met de biopsieprocedure. Om deze reden is het aantal toegestane biopten strikt beperkt in transplantatieprocedures, een factor die het vastleggen van dynamische veranderingen en tijdreeksanalyses via deze methode12,13,14belemmert . De voordelen van een histologische analyse moeten worden afgewogen tegen de risico’s die aan de methodologie verbonden zijn. De waarde van histologische bevindingen staat buiten kijf, maar ze verklaren de moleculaire mechanismen van de afwijkingen niet.

Metabolomics en lipidomics zijn de jongste domeinen van de “-omics” wetenschappelijke familie. De volledige set van lage moleculaire (<1,200 Da) menselijke metabolieten en lipiden verbonden binnen een metabolisch netwerk wordt gedefinieerd als een menselijke metabolome. Het genoom blijft gedurende zijn hele levensduur relatief constant, met lichte wijzigingen veroorzaakt door mutaties die zelden voorkomen. De metabolome is het product van genexpressie, dat zeer gevoelig is voor veranderingen in alle biologische processen en omgevingsfactoren. Het dynamische karakter van metabolieten en lipiden maakt ze perfecte indicatoren van de huidige orgaanconditie7,8,15,16. De SPME-methode die in het bovengenoemde protocol wordt voorgesteld, maakt het mogelijk om veranderingen in het orgaan tijdens het behoud ervan op te sporen, te beginnen met het verwijderen van organen uit het lichaam van de donor tot revascularisatie bij de ontvanger. De kleine diameter van de sonde (~ 200 μm) zorgt voor minimale invasieve werking en zorgt voor verschillende bemonsteringen van hetzelfde orgaan zonder schade aan het weefsel. Het uitvoeren van studies met behulp van nier, als de meest getransplanteerde orgaan, zorgt voor een beter begrip en verdere karakterisering van de metabole trajecten die verantwoordelijk zijn voor het afnemen van de kwaliteit en functie van grafts. De mogelijkheid van het monitoren van wijzigingen na verloop van tijd is zeker een belangrijk voordeel van de techniek in vergelijking met conventionele invasieve methoden zoals biopsie. De momenteel gepresenteerde analyse geïdentificeerd veranderde concentraties van verschillende groepen lipiden en metabolieten, met name van essentiële aminozuren, purines, purine nucleosides, en glycerophosfopiden. Deze resultaten komen overeen met eerdere weefselanalyserapporten5,6,17,18,19,20. Tot op heden zijn de meeste wetenschappelijke rapporten die gebruikmaken van metabolomics of lipidomics om processen te verklaren die complicaties veroorzaken na transplantatie of ischemie/reperfusieletsel (IRI) verschijnselen beperkt tot analyse van biofluïden21,22,23.

Elke klinische toepassing vereist optimalisatie van het bemonsteringsprotocol om ervoor te zorgen dat de prestaties van de analysemethode voldoen aan de verwachte criteria. In dit verband is het voordeel van het gebruik van SPME de mogelijkheid om de voorwaarden voor verschillende experimentele ontwerpen aan te passen. De verscheidenheid aan toegankelijke extractiefasen biedt een breed spectrum van geëxtraheerde metabolieten met gediversifieerde polariteiten. Tegelijkertijd kan dit worden beschouwd als een beperking van de methode vanwege het feit dat elke sorbent selectiviteit biedt ten opzichte van specifieke kenmerken en niet alle verbindingen in de monstermatrix extraheert. Opgemerkt moet worden dat SPME coatings alleen extraheren via vrije moleculen, en gewoon niet interageren met een gebonden fractie van de analyt. De biocompatibiliteit van de coatings introduceert geen toxiciteit in het weefsel, terwijl de extractie van grote moleculen zoals eiwitten wordt beperkt; als gevolg hiervan worden de enzymatische processen al in het stadium van monsterverzameling geremd en wordt de aanwezigheid van artefacten geminimaliseerd, wat een groot voordeel is ten opzichte van alternatieve bemonsteringsmethoden. De lengte van de coating beïnvloedt de efficiëntie van de extractie (d.w.z. de lengte van de coating wijst het oppervlak en het volume van de extractiefase aan); dus, langere coatings opleveren hogere terugvorderingen. Aan de andere kant zorgen kortere coatings voor een hogere ruimtelijke resolutie. Voor betrouwbare resultaten is het cruciaal om de sonde onder te dompelen op exact dezelfde diepte van de nierschors. Het te diep inbrengen veroorzaakt het risico om de nier medulla binnen te gaan. De tijd van de extractie is ook evenredig aan de extractie-efficiëntie. Daarom is de keuze van een optimale extractietijd een van de meest kritieke stappen in de ontwikkeling van SPME-methoden. De nauwkeurigheid van de tijdmeting biedt de hoogste herhaalbaarheid. In biologische toepassingen zoals die besproken, is er altijd een compromis tussen de gevoeligheid en herhaalbaarheid van het analytische protocol en de beperkingen van de medische procedure. Hoewel evenwichtsextractie de hoogste gevoeligheid biedt, worden om veiligheidsredenen vaak pre-evenwichtsvoorwaarden gebruikt in dergelijke toepassingen, omdat de extractietijd de totale duur van de operatie niet mag beïnvloeden. De efficiëntie van de desorptie wordt bepaald door het tijdstip van het proces en de samenstelling van het desorptieoplosmiddel, dat compatibel moet zijn met de mobiele fase die wordt gebruikt voor chromatografische scheiding9,10,11.

Een van de belangrijkste vereisten voor diagnostische instrumenten die worden gebruikt voor intrachirurgische beoordelingen is het tijdstip van analyse. De huidige pogingen worden gedaan om een snel instrument te ontwikkelen voor in vivo SPME-extractie die rechtstreeks via microfluïde open interface (MOI)24 of gecoate bladespray (CBS)25wordt gekoppeld aan een massaspectrometer. Dergelijke benaderingen zouden het mogelijk maken om analytische resultaten in reële of bijna realtime te onthullen. Het gebruik van dergelijke methoden voor pre-interventieanalyses van metabole en lipidomische profielen zou het besluitvormingsproces tijdens transplantatieprocedures kunnen verbeteren, waardoor de best mogelijke gepersonaliseerde aanpak en snelle respons in geval van orgaanfalen mogelijk worden.

Samengevat wordt verondersteld dat het voorgestelde protocol volledige metabolische en lipidomische profielen van niertransplantaten mogelijk zal maken, wat op zijn beurt een uitgebreide beoordeling van de kwaliteit van het orgaan en de karakterisering van de processen die verantwoordelijk zijn voor ischemie-reperfusieletsel zou bieden. De nieuwigheid van het project omvat het gebruik van solid-phase microextraction (SPME), het aanbieden van lage invasieve bemonstering van levende systemen, in combinatie met een van de meest innovatieve technologieën beschikbaar voor metabolomics en lipidomics analyse (bijvoorbeeld, de Orbitrap hoge resolutie massaspectrometer). SPME combineert het verzamelen, afzuiden en blussen van metabolieten in één stap, waardoor het een perfect hulpmiddel is voor snelle analyse. Er wordt verwacht dat dit protocol zal helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot wat pre-transplantatie voorwaarden van de nier verantwoordelijk zijn voor vertraagde orgaanfunctie of de disfuncties ervan na transplantatie, evenals hoe de graft behoud protocol beïnvloedt de biochemie van het orgaan. Dergelijke kennis zou niet alleen aanzienlijke gevolgen hebben voor de preventie van mogelijke complicaties in verband met transplantatie, maar kan ook bijdragen tot het verbeteren van de huidige protocollen voor het behoud van graft, waardoor het verlies van levensvatbaar transplantatieweefsel en het verlies van mensenlevens tot een minimum worden geminimaliseerd. De voorgestelde oplossing zal de deur openen voor verder onderzoek op dit gebied, met inbegrip van de validatie van specifieke potentiële biomarkers en verbetering van therapeutische resultaten in de transplantatie.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De studie werd ondersteund door subsidie Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 van National Science Centre. De auteurs willen MilliporeSigma erkennen, een bedrijf van Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland voor het leveren van SPME-apparaten. De life science business van Merck opereert als MilliporeSigma in de VS en Canada. Ook willen de auteurs Thermo Fisher Scientific bedanken voor de toegang tot Q-Exactive Focus orbitrap massaspectrometer. De auteurs willen dr. Aleksandra Woderska-Jasińska en het personeel van de afdeling Transplantatieologie en Algemene Chirurgie in Bydgoszcz bedanken voor hun vriendelijke hulp bij het project. BB wil prof. Janusz Pawliszyn bedanken voor de mogelijkheid van monstercollectie in toronto General Hospital tijdens haar verblijf aan de Universiteit van Waterloo.

Materials

Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. . Organ Procurement and Transplantation Network Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019)
  2. Branger, P., Undine, S. . Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research – How far are we from daily practice. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

タグ

Chemical BiopsyOrgan TransplantationGraft Quality AssessmentSPME ProbesBiocompatible CoatingsTumor AnalysisPreconditioning MixtureSterilizationKidney CortexMetabolomic AnalysisLipidomic AnalysisLiquid ChromatographyMass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image