توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ

غالباً ما تستخدم keratinocytes الإنسان المشتقة من الجلد البشري كنموذج الخلوية لدراسة بيولوجيا البشرة^1,2,3,4. يمكن أن تكون على غرار الطبقات من البشرة من قبل التمايز keratinocyte، إما في 2D مغمورة monolayer أزياء أو 3D الهواء رفع organotypic نموذج^{2،3،5،6،7}. على الرغم من أن النماذج ثلاثية الأبعاد أصبحت ذات أهمية متزايدة لتقييم بنية الجلد ووظيفته ، فإن نماذج التمايز 2D لا تزال تستخدم على نطاق واسع ، بسبب راحتها وإمكانية توليد أعداد كبيرة من الخلايا للتحليلات.

وقد طبقت شروط مختلفة لحفز التمايز keratinocyte في 2D، بما في ذلك إضافة المصل، وارتفاع تركيز الكالسيوم، وانخفاض درجة الحرارة وتثبيط مستقبلات عامل النمو البشرة^2،3. وقد تم التحقق من صحة كل من هذه الطرق من قبل عدد من الجينات علامة التمايز keratinocyte وتبين أن تكون فعالة في تقييم تمايز keratinocyte, بما في ذلك في ظل الظروف المرضية. ومع ذلك ، فإن هذه الظروف التعريفية تظهر أيضا اختلافات في كفاءة التمايز والحركية عند فحص لوحات محددة من الجينات علامة^2،3.

واحدة من هذه الأساليب ينطوي keratinocyte منع الاتصال واستنفاد عوامل النمو في الثقافة المتوسطة^8. وقد تبين أن الكيراتينوسيات يمكن أن تفرق تلقائيا عندما الخلايا تصل إلى كثافة كاملة.  ويمكن أن يؤدي استبعاد عوامل النمو في الوسط الثقافي إلى زيادة تعزيز التمايز. وقد تبين أن الأسلوب الذي يجمع بين تثبيط الاتصال وعوامل النمو المستنفدة لتوليد خلايا الكيراتينوسيات المتمايزة مع أنماط التعبير الجيني مماثلة للبشرة الطبقية الطبيعية عند استخدام العديد من علامات البشرة³، مما يشير إلى أن هذا النموذج مناسب لدراسة تمايز الكيراتينوسيت العادي. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن تحليلين شاملين للتعبير الجيني للتمايز الكيراتينوتي باستخدام هذا النموذج^9،10. وقد قام الباحثون بالتحقق من صحة هذا النموذج على المستوى الجزيئي وأظهروا أنه يمكن استخدامه لدراسة تمايز الكيراتينوسيات العادي والمُرَض.

يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بطريقة التمايز في المختبر والتحليل الجزيئي للخلايا المتمايزة باستخدام الحمض النووي الريبي الريبي-الصد. كما يوضح توصيف نسخة الخلايا في يوم التمايز 0 (مرحلة الانتشار)، واليوم 2، واليوم 4، واليوم السابع (التمايز المبكر والمتوسط والمتأخر على التوالي). وتبين أن الكيراتينوسيات المختلفة تعرض أنماط التعبير الجيني التي تشبه إلى حد كبير الخلايا أثناء التقسيم الطبقي البشرة. لدراسة ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أمراض الجلد، قمنا بتطبيق نفس خط الأنابيب التجريبية والتحليلية للتحقيق في keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 التي هي مستمدة من المرضى الذين يعانون من ectrodactyly، التفكيك وشقوق الشفة / الحنك متلازمة^11،12. ويركز هذا البروتوكول على التمايز في المختبر من keratinocytes وكذلك التحليل الحيوي اللاحقة من الحمض النووي الريبي- سيك. خطوات أخرى في الإجراء الكامل مثل استخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد عينة RNA-seq وبناء المكتبة، هي موثقة جيدا ويمكن اتباعها بسهولة، وخصوصا عند استخدام العديد من مجموعات تجارية شائعة الاستخدام. لذلك، يتم وصف هذه الخطوات باختصار فقط في البروتوكول. وتظهر البيانات أن هذا خط الأنابيب هو مناسبة لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز البشرة في الكيراتينوسيات صحية والمُرَكَّرة.