דגימה וניתוח של אותות ריח בעלי חיים

מעט מאוד ידוע על השינויים הכימיים העומדים ביסוד אותות הריח בבעלי^{חיים 1}, גם בגלל אתגרים מתודולוגיים בהקלטה וכימות פרופילים כימיים נדיפים של ריחות². ישנן מספר מלכודות פוטנציאליות בעת עבודה עם מטריצות כימיות מורכבות ביותר; אלה כוללים בעת דגימה וניתוח דגימות ריח³.

במרכז המדע ע”ש רוזלינד פרנקלין, אוניברסיטת וולברהמפטון, אנו מבצעים ניתוח של ריחות וסימני ריח כדי להבין כיצד בעלי חיים יכולים להשתמש בהם. אנו משלבים סמיוכימיה עם אקולוגיה התנהגותית, אנדוקרינולוגיה וציטולוגיה כדי לשפר את הבנתנו את התפקיד שמילאו אותות חוש הריח בתקשורת בין בעלי חיים.

פיתחנו מתודולוגיה ולאחר מכן ניתחנו ריחות וסימונים ממגוון מינים כולל כמה פרימטים לא אנושיים (כלומר, למורים מוכתרים, למורים אדומי עור, קופי מקוק יפניים, בבונים זיתים, שימפנזים) ויונקים אחרים (כלומר, חתולים, פרות). אספנו וניתחנו מגוון דגימות, כולל שתן, צואה, הפרשות ריח של שיער ובלוטת ריח. ריחות וסימני ריח אלה מורכבים מתערובות מורכבות של תרכובות ולכן כל מתודולוגיה המשמשת לניתוח שלהם צריכה לכלול צורה כלשהי של טכניקה הפרדה. כפי שמודגם, הם מתרחשים גם במגוון מטריצות המחייב שימוש בטכניקות כדי לחלץ את מרכיבי העניין.

מחקרים^קודמים על ידי Vaglio et al. 4 ומחברים אחרים⁵ השתמשו מיצוי מרחב ראש דינמי (DHS) עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS) בעוד מיצוי ממס ישיר⁶ עקירות ממס מורכבים⁷ שימשו גם. במיוחד, דגימת headspace דינמית כרוכה בטיהור מרחב הראש עם נפח ידוע של גז אינרטי שבסופו של דבר מסיר את כל התרכובות הנדיפות למעט אלה המראות זיקה חזקה למטריצה לדוגמה (לדוגמה, תרכובות קוטביות בדגימות מימיות).

עבור המתודולוגיה הנוכחית, אימצנו את הטכניקה של מרחב ראש מוצק שלב microextraction (HS-SPME) יחד עם GC-MS. בפרט, פיתחנו ושיפרנו את המתודולוגיה שכבר נעשה בה שימוש על ידי Vaglio et al. במעבדת GC-MS הקודמת שלה^8,9,10.

טכניקות מיצוי ממס יעילים מאוד לניתוח תרכובות קטנות, נדיפות מאוד (אשר אחרת ניתן לאבד בקלות מדגם) כי שיטות אלה לשתק תרכובות על תמיכה יציבה, שלב מוצק. HS-SPME משתמש בסיבים מצופים פולימר סופח כדי ללכוד תרכובות נדיפות במרחב הראש מדגם או כדי לחלץ תרכובות מומסות על ידי טבילה בנוזל ביולוגי^{מימית 11}. ציפוי פולימר אינו קושר את התרכובות בחוזקה, ולכן על ידי חימום ביציאת ההזרקה של GC הם יכולים להיות מוסרים. שיטה זו היא חזקה יותר מאשר טכניקות מיצוי ממס וגם יעיל יותר מאשר DHS.

בגישה הנוכחית דגימות כלולות בתוך בקבוקוני זכוכית. בקבוקונים אלה מחוממים לטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לדמות את טמפרטורת הגוף של בעלי החיים על מנת לקדם את הרכיבים הנדיפים של סימן הריח כדי לכבוש את ראש החלל של הבקבוקון. סיב SPME, מצופה 65 מיקרומטר של חומר סורבנט polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB), נחשף לסביבת headspace ורכיבים נדיפים מהמדגם נספגים על הסיבים. על חימום הסיבים ביציאת הכניסה של GC-MS, הרכיבים הנדיפים הם desorbed מן הסיבים ולאחר מכן מופרדים על ידי GC. דפוסי פיצול ספקטרליים של מסה מתקבלים עבור כל רכיב באמצעות MS. בהשוואה של ספקטרום מסה אלה מול מסדי נתונים ספקטרליים המוניים, ניתן לזהות באופן לא סופי את מרכיבי סימן הריח. באמצעות דוגם אוטומטי, אנו מסוגלים לנתח דגימות מרובות בקבוצות באופן עקבי.

בהתחשב בכך שלכל סוג של סיבי SPME יש זיקה שונה לכימיקלים קוטביים, הסיבים נבחרים בדרך כלל בהתאם לקוטביות ו/או המשקל המולקולרי של התרכובות הכימיות המשמשות כיעד. בנוסף, תנאי GC משתנים בהתאם לסוג עמודת GC ואת המאפיינים של תרכובות כימיות היעד.

טכניקה זו מאפשרת ניתוח חצי-כמותי של הרכיבים הנדיפים של סימוני ריח על-ידי מתן אפשרות להפרדה וזיהוי זמני של הרכיבים במדגם, ולאחר מכן ניתוח יחסי אזור שיא כדי לחפש מגמות שיכולות לסמן רכיבים של סימון הריח שעשויים להיות מעורבים באיתות.

נקודות החוזק העיקריות של גישה נוכחית זו הן:

• טווח הסוגים לדוגמה שניתן לנתח.
• אין צורך בהכנה או עקירות מדגם מורכבות.
• היכולת לנתח רכיבים נדיפים.
• היכולת להפריד את מרכיבי התערובת.
• כדי שתוכל לזהות את הרכיבים שזוהו.
• היכולת לספק מידע חצי כמותי ופוטנציאלי כמותי על הרכיבים שזוהו.