概要

Phasic Dopamin'in Ventral Tegmental Alan Reseptör Reseptör Reseptör Düzenlemesini Değerlendirmek için Hızlı Taramalı Döngüsel Voltammetri (CIS-FSCV) ile Kombine infüzyon ve stimülasyon

Published: April 23, 2020
doi:

概要

Bu protokolün amacı, ventral tegmental alan reseptörlerini, alt bölüm dopamin salınımı için katkılarını incelemek için doğrudan manipüle etmektir.

Abstract

Ventral tegmental alandan (VTA) çekirdek akumbens’e phasic dopamin (DA) salınımı, ödül işleme ve pekiştirme öğreniminde önemli bir rol oynar. VTA kontrol fazsik DA sürümüne gelen çeşitli nöronal girdilerin, ödül işleme ve pekiştirme öğrenimini kontrol eden devrenin daha iyi bir resmini nasıl sağlayabileceğini anlamak. Burada, farmakolojik agonistlerin ve antagonistlerin VTA içi kanül infüzyonlarını, in vivo hızlı tarama siklik voltammetri (FSCV) ile ölçülen stimülasyon çağrılı fazik DA salınımı (kombine infüzyon ve stimülasyon veya BDT) ile birleştiren bir yöntemi açıklıyoruz. Uyuşturulmuş sıçanlarda CIS-FSCV kullanılarak, nükleus akumbens çekirdeğinde kayıt yaparken VTA’yı bir kavunla donatılmış bipolar bir elektrotla elektriksel olarak uyararak fazik bir DA yanıtı çağrılabilir. Farmakolojik agonistler veya antagonistler, belirli VTA reseptörlerinin faik DA salınımını yönlendirmedeki rollerini araştırmak için doğrudan stimülasyon bölgesinde aşılanabilir. CIS-FSCV’nin önemli bir yararı, VTA reseptör fonksiyonunun in vitro çalışmalara dayanarak in vivo olarak çalışılabilmesidir.

Introduction

Ventral tegmental bölgeden (VTA) çekirdeğe (NAc) phasic dopamin (DA) salınımı ödülle ilgili davranışlarda hayati bir rol oynar. VTA DA nöronları tonik benzeri bir ateşlemeden (3-8 Hz) patlama benzeri bir ateşlemeye (>14 Hz)1‘e geçer ve bu da NAc’ta vurgulu DA salınımı üretir. VTA, tonikten patlama ateşlemeye geçişi kontrol etmek için iyi konumlandırılmış çeşitli somatodendritik reseptörleri ifade eder2,3,4,5. Bu reseptörlerden hangisinin ve ilgili girdilerinin belirlenmesi, fazik DA salınımını kontrol etmek, ödülle ilgili devrelerin nasıl düzenlendiği konusundaki anlayışımızı derinleştirmeyecektir. Burada açıklanan metodolojinin amacı, hızlı tarama siklik voltammetri (CIS-FSCV) ile kombine infüzyon ve stimülasyon, VTA reseptörlerinin fazik DA salınımını sürüşteki işlevselliğini hızlı ve sağlam bir şekilde değerlendirmektir.

Kombine infüzyon ve stimülasyon (BDT) terimi, bir grup nöron üzerindeki reseptörleri farmakolojik olarak manipüle etmeyi (burada VTA) ve bu nöronları reseptörün işlevini incelemek için uyarmayı ifade eder. Uyuşturulmuş sıçanda, VTA’yı hızlı tarama siklik voltammetrisi (FSCV) ile ölçülen NAc çekirdeğinde büyük bir fazik DA sinyali (1-2 μM) uyandırmak için elektriksel olarak uyarırız. Stimülasyon yerindeki farmakolojik ilaçların (yani reseptör agonistlerinin/antagonistlerinin) infüzyonları, uyandırılan fazik DA salınımındaki sonraki değişimi gözlemleyerek VTA reseptörlerinin işlevini ölçmek için kullanılabilir. FSCV, hem yüksek uzamsal (50-100 μm) hem de zamansal (10 Hz) çözünürlüğe sahip elektrokimyasal bir yaklaşımdır ve ödülle ilgili, vurgulu DA etkinliklerini ölçmek için çok uygundur6,7. Bu çözünürlük, mikrodiyaliz gibi diğer in vivo nörokimyasal ölçümlerden daha incedir. Bu nedenle, CIS-FSCV birlikte, fazik dopamin salınımının VTA reseptör regülasyonunun değerlendirilmesi için çok uygundur.

VTA reseptör fonksiyonunu araştırmanın yaygın bir yolu, bu reseptörlerin nöronların atış hızını nasıl değiştirdiğini ele alan elektrofizyolojik yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanmaktır1,8. Bu çalışmalar, aktivasyon üzerine DA ateşlemesinde hangi reseptörlerin yer aldığını anlamada oldukça değerlidir. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece akson terminalde (yani bir nörotransmitterin salınmasında) aşağı akışta neler olabileceğini önerebilir. CIS-FSCV, VTA patlama-ateşleme, fazik DA salınımının VTA dendritleri ve hücre gövdeleri üzerinde bulunan reseptörler tarafından nasıl düzenlendiğini cevaplayarak bu elektrofizyolojik çalışmalar üzerine inşa edilir. Bu nedenle, CIS-FSCV bu elektrofizyoloji çalışmaları üzerine inşa etmek için çok uygundur. Örnek olarak, nikotinik reseptör aktivasyonu VTA9’dapatlama ateşlenmesine neden olabilir ve anestezik sıçandaki CIS-FSCV, VTA’daki nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) aktivasyonunun NAc10 , 11’dekifalizIK DA salınımını da kontrol ettiğini göstermek için kullanılmıştır.

Phasic DA regülasyonunun mekanistik incelemesi de yaygın olarak ilaçların banyo uygulaması ile birlikte dilim preparatları kullanılarak incelenir. Bu çalışmalar genellikle hücre gövdeleri genellikle dilimden çıkarıldığı için dopamin terminallerinden phasic DA salınımının presynaptik düzenlemesine odaklanır12. Bu preparatlar dopamin terminalleri üzerindeki presinaptik reseptör etkilerini incelemek için değerlidir, cis-FSCV ise dopamin nöronları üzerindeki somatodendritik reseptör etkilerini ve VTA’ya presynaptik girdileri incelemek için daha uygundur. Bu ayrım önemlidir, çünkü VTA’daki somatodendritik reseptör aktivasyonu NAc presynaptik reseptör aktivasyonundan farklı bir etkiye sahip olabilir. Gerçekten de, NAc’de dopaminerjik presynaptik nAChR’leri bloke etmek, patlama ateşlemesi sırasında phasic dopamin salınımını yükseltebilir13, tam tersi ise VTA somatodendritc nAChRs10,11‘de geçerlidir.

CIS-FSCV, VTA reseptörlerinin faik DA salınımını düzenleme yeteneğini incelemek için ideal bir yaklaşımdır. Daha da önemlisi, bu yaklaşım anestezi veya serbest hareket ile bozulmamış bir sıçanda gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım akut çalışmalar için uygundur, temel durumunda reseptör fonksiyonunu incelemek için10,14 ve ilaç maruziyeti veya davranışsal manipülasyondan sonra bir reseptördeki fonksiyonel değişiklikleri değerlendirebilen uzun vadeli çalışmalar11,15.

Protocol

Tüm deneyler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na göre yapıldı ve hem Elizabethtown College hem de Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu protokol CIS-FSCV kullanımının uyuşturulmuş sıçan hazırlığına özgüdür. 1. Presurgical hazırlıklar Elektrot çözeltisi hazırlama Elektrot dolum çözeltisini yapmak için, 140 mM potasyum klorür<su…

Representative Results

CIS-FSCV, VTA N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR), nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChRs) ve NAc çekirdeğinde fazik DA salınımının yönlendirilmesinde miskarinik asetilkolin reseptörlerinin (mAChRs) işlevini incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 negatif kontrol için temsili verileri gösterir, %0,9 salin infüzyonu, öncesi (taban çizgisi) ve 9 dk postenfüzyon (salin). Şekil 2, y ekseninde pota…

Discussion

CIS-FSCV, phasic DA salınımı altında kalan VTA reseptör mekanizmalarını araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlar. Doğru bir kayıt sağlamak için iki kritik adım vardır. İlk olarak, uyarılan DA sinyalinde çok az sürüklenme ile kararlı bir taban çizgisi kaydı elde edilmelidir. Kararlı bir kayıt oluşturma olasılığını artırmanın önemli bir yolu, elektrodun hem 60 Hz hem de 10 Hz’de (tipik olarak 60 Hz’de 15 dakika ve 10 Hz’de 10 dakika) döngü yapmak için bolca zamanı olduğundan emi…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışmalar Elizabethtown College (R.J.W, M.L. ve L.M.), NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) ve Yale School of Medicine (N.A.) tarafından desteklendi.

Materials

Electrode Filling Solution/Supplies
Micropipette World Precision Instruments MF286-5 (28 gauge)
Potassium Acetate Sigma 236497-100G
Potassium Chloride Sigma P3911-25G
Electrode Supplies
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22 Note: horizontal pullers can be used as well
Glass capillary A-M systems 626000
Insulated wires for electrodes Weico Wire and Cable Incorporated UL 1423 Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire
Light Microscope (for viewing and cutting electrode) Fischer Scientific M3700
Pin Phoenix Enterprises HWS1646 To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage
Putty Alcolin 23922-1003 Used to place electrode on while cutting the carbon fiber
Scalpal Blade World Precision Instruments 500239 For cutting carbon fiber to the apprpriate length
Silver Wire Sigma 327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday Cage U-Line H-3618 (36" x 24" x 42")
Potentiostat Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
Stimulator Hardware
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4 Neurolog 800A
Infusion/Stimulation Supplies
Infusion Pump New Era Syringe Pump NE-300
Internal Cannula PlasticsOne C315I/SPC INTERNAL 33GA
Microliter Syringe Hamilton 80308
Tubing PlasticsOne C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Cannula Holder Kopf Instruments 1776 P-1
Cotton Tip Applicators Vitality Medical 806
Electrode Holder Kopf Instruments 1770
Heating Pad Kent Scientific RT-0501
Povidone Iodine Vitality Medical 29906-004
Screws Stoelting Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 1.59 mm O.D., 3.2 mm long
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Square Gauze Vitality Medical 441408
Stereotax Kopf Instruments Model 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
Formulin Sigma 1004960700
Power supply BK Precision 9110
Sucrose Sigma 80497
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma Aldrich A5282
N-methyl-D-aspartate Sigma Aldrich M3262
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) Sigma Aldrich M9020
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) Sigma Aldrich S0929

参考文献

  1. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  2. Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
  3. Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
  4. Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
  5. Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
  6. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
  7. Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
  8. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
  9. Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
  10. Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
  11. Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
  12. John, C. E., Jones, S. R., Michael, A. C., Borland, L. M. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
  13. Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
  14. Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
  15. Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
  16. Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
  17. Borland, L. M., Michael, A. C., Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
  18. Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
  19. Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
  20. Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
  21. Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
  22. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  23. Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
  24. Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
  25. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  26. Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
  27. Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
  28. Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
  29. Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  30. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  31. Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
  32. Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
  33. Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).

Play Video

記事を引用
Wickham, R. J., Lehr, M., Mitchell, L., Addy, N. A. Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine. J. Vis. Exp. (158), e60886, doi:10.3791/60886 (2020).

View Video