Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.
De ziekte van Crohn is het meest gediagnosticeerde type inflammatoire darmziekte. Chronische ontsteking zich ontwikkelt in de darm leidt tot peristtiek stoornis en schade van intestinale slijmvlies en lijkt te worden geassocieerd met een verhoogd risico op darmneoplastische transformatie. Accumuleren bewijs geeft aan dat oestrogenen en oestrogeen receptoren invloed hebben op niet alleen hormoon-gevoelige weefsels, maar ook andere weefsels niet direct gerelateerd aan oestrogenen, zoals de longen of dikke darm. Hier beschrijven we het protocol voor de succesvolle immunofluorescentie kleuring van oestrogeenreceptoren in de dikke darm verkregen uit een murinemodel van de ziekte van TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Een gedetailleerd protocol voor de inductie van de ziekte van Crohn bij muizen en darmpreparaat wordt verstrekt, evenals een stapsgewijze immunohistochemische procedure met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde darmsecties. De beschreven methoden zijn niet alleen nuttig voor oestrogeen receptor detectie en oestrogeen signalering onderzoek in vivo, maar kan ook worden toegepast op voor andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis.
De ziekte van Crohn (CD) is een inflammatoire darmziekte (IBD) die zich manifesteert als chronische darmontsteking. De etiologie van CD is slecht begrepen, maar er zijn een paar belangrijke factoren die verantwoordelijk lijken te zijn voor de ontwikkeling van cd’s, waaronder darmmicrobiota, en genetische en omgevingsfactoren, zoals dieet of stress1. Voor een beter begrip van de pathogenese van de ziekte van Crohn zijn verschillende modellen van darmontsteking gebruikt2,3,4,5,6,7. In dit artikel presenteren we resultaten verkregen uit een 2,4,6-trinitrobenzeensulfoonzuur (TNBS)-geïnduceerde murinemodel van CD.
Het is gedocumenteerd dat oestrogenen in staat zijn om chronische darmontsteking te moduleren8,,9,10,11,12. De biologische activiteit van oestrogenen wordt bemiddeld door cognate receptoren, waaronder nucleaire oestrogeenreceptoren (ERs), d.w.z. ERα (gen ESR1) en ERβ (gen ESR2), evenals G-eiwit-gekoppeldoestrogeenreceptor, d.w.z. GPER (gen GPER1),aangeduid als membraangebonden ER13,14. Er zijn verschillende methoden voor het bepalen van het niveau van oestrogeen receptoren, maar slechts een paar kunnen worden gebruikt om ze te visualiseren in de darm.
Immunohistochemie (IHC) is een veelgebruikte methode in klinische en basisstudies voor de detectie van bepaalde antigenen in cellen of weefsels met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen. IHC lijkt een belangrijke methode in weefselstructuur visualisatie, evenals in de identificatie en lokalisatie van specifieke eiwitten, die van cruciaal belang kunnen zijn voor het begrijpen van de ontwikkeling van colitis. Hier presenteren we een compleet en gevalideerd protocol voor immunohistochemische visualisatie van oestrogeenreceptoren in de darm met behulp van immunofluorescentie.
Er zijn tal van diermodellen voor IBD pathofysiologie onderzoek, met inbegrip van genetische, immunologische of spontane modellen, evenals chemisch geïnduceerde modellen15. Onder de verschillende soorten diermodellen van colitis, chemisch geïnduceerde modellen zoals de TNBS-geïnduceerde model beschreven in dit protocol, zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen. Het tnbs-geïnduceerde murinemodel van colitis heeft verschillende klinische symptomen gerelateerd aan de pathologische basi…
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd gepubliceerd dankzij de financiële steun van de autoriteiten van de Universiteit van Lodz: vicerector wetenschappelijk onderzoek, vicerector nationale en internationale samenwerking en decaan van de faculteit Biologie en Milieubescherming. Damian Jacenik werd ondersteund door subsidies (2017/24/T/NZ5/00045 en 2015/17/N/NZ5/00336) van National Science Centre, Polen.
Animals | |||
BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
Equipment | |||
Caliper | VWR | 62379-531 | |
Cardboard block | NA | NA | |
Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
Histological box | Marfour | LN.138747 | |
Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
Sterile gauze | NA | NA | |
Sterile scissor | NA | NA | |
Sterile tweezer | NA | NA | |
Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
Reagents | |||
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |