İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi
概要
Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.
Abstract
Crohn hastalığı inflamatuar barsak hastalığının en çok tanı konulan tipidir. Bağırsakta gelişen kronik inflamasyon peristalsis bozukluğu ve bağırsak mukozası hasarına yol açar ve kolon neoplastik dönüşüm riski ile ilişkili gibi görünüyor. Kanıt birikmesi östrojen ler ve östrojen reseptörleri sadece hormona duyarlı dokuları etkiler gösterir, ama aynı zamanda diğer dokular doğrudan östrojen ile ilgili değil, akciğerler veya kolon gibi. Burada, tnbs kaynaklı Crohn hastalığının bir murine modelinden elde edilen kolonda östrojen reseptörlerinin başarılı immünororesans boyama protokolünü açıklıyoruz. Crohn hastalığının fare ve bağırsak preparatına indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol ve formalin-sabit parafin gömülü bağırsak bölümleri kullanılarak adım adım immünohistokimyasal bir prosedür sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler sadece östrojen reseptör algılama ve in vivo östrojen sinyal araştırma için yararlı değil, aynı zamanda kolit gelişiminde rol olabilir diğer proteinler için uygulanabilir.
Introduction
Crohn hastalığı (CD) kronik bağırsak iltihabı olarak kendini gösteren inflamatuar bir barsak hastalığıdır (IBD). CD etiyolojisi kötü anlaşılmaktadır, ancak cd gelişimi için sorumlu gibi görünen birkaç önemli faktörler vardır, bağırsak mikrobiyota dahil, ve genetik ve çevresel faktörler, diyet veya stres gibi1. Crohn hastalığının patogenezinin daha iyi anlaşılması için, bağırsak iltihabının çeşitli modelleri,2,3,34,5,6,7olarak kullanılmaktadır. Bu makalede, CD’nin 2,4,6-trinitrobenzene sülfonik asit (TNBS) kaynaklı murine modelinden elde edilen sonuçları satıyoruz.
Bu östrojenler kronik bağırsak iltihabı8,9,,10,,11,12modüle yeteneğine sahip olduğu belgelenmiştir. Östrojenlerin biyolojik aktivitesi, aralarında nükleer östrojen reseptörleri (ER), yani ERα (ESR1geni) ve ERβ (ESR2geni) ve G proteinle birleşen östrojen reseptörü, yani GPER (gen GPER1),membrana bağlı ER13,14gibi konjenital reseptörler tarafından aracılık edilir. Östrojen reseptörlerinin düzeyini belirlemek için çeşitli yöntemler vardır, ama sadece birkaç bağırsakta onları görselleştirmek için kullanılabilir.
İmmünohistokimya (IHC), florokrom konjuge antikorları olan hücre veya dokularda bazı antijenlerin saptanması için klinik ve temel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. IHC doku yapısı görselleştirme önemli bir yöntem gibi görünüyor, yanı sıra belirlenmesi ve kolit gelişimini anlamak için çok önemli olabilir belirli proteinlerin lokalizasyonu. Burada, immünoresans kullanarak bağırsakta östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görüntüleme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetik, immünolojik veya spontan modeller de dahil olmak üzere IBD patofizyolojisi muayenesi için çok sayıda hayvan modeli, yanı sıra kimyasal olarak indüklenen modeller15vardır. Kolitin çeşitli hayvan modelleri arasında, bu protokolde açıklanan TNBS kaynaklı model gibi kimyasal kaynaklı modeller nispeten ucuz ve elde edilmesi kolaydır. Kolitin TNBS’ye bağlı murine modelinde CD’nin patolojik temeli ile ilgili çeşitli klinik semptomlar vardır. İndüklenen kolit olan hayvanla…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Lodz Üniversitesi yetkililerinin mali desteği sayesinde yayınlandı: Bilimsel Araştırmadan Sorumlu Rektör Yardımcısı, Ulusal ve Uluslararası İşbirliğinden Sorumlu Rektör Yardımcısı ve Biyoloji ve Çevre Koruma Fakültesi Dekanı. Damian Jacenik, Polonya Ulusal Bilim Merkezi’nden (2017/24/T/NZ5/00045 ve 2015/17/N/NZ5/00336) hibeler ile desteklenmiştir.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
参考文献
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
