概要

Визуализация рецепторов эстрогена в колонах мышей с TNBS-индуцированной болезнью Крона с использованием иммунофлюоресценции

Published: March 12, 2020
doi:

概要

Протокол представляет собой полную проверенную модель Murine, индуцированную TNBS, болезнь Крона и методы визуализации рецепторов эстрогена иммуногистохимией с использованием иммунофлюоресценции формалино-фиксированных секций толстой кишки, встроенных в парафин.

Abstract

Болезнь Крона является наиболее диагностируется тип воспалительных заболеваний кишечника. Хроническое воспаление, развивающаяся в кишечнике, приводит к нарушению перистальции и повреждению слизистой оболочки кишечника и, кажется, связано с повышенным риском неопластической трансформации толстой кишки. Накопление доказательств указывает на то, что эстрогены и рецепторы эстрогена влияют не только на гормоночувствительные ткани, но и на другие ткани, не имеющие прямого отношения к эстрогенам, таким как легкие или толстой кишки. Здесь мы описываем протокол для успешного иммунофлуоресцентного окрашивания рецепторов эстрогена в толстой кишке, полученного от модели мурина болезни Крона, индуцированной TNBS. Предоставляется подробный протокол для индукции болезни Крона у мышей и подготовки кишечника, а также пошаговая иммуногистохимическая процедура с использованием формалино-фиксированного парафин-встроенных секций кишечника. Описанные методы не только полезны для обнаружения рецепторов эстрогена и эстроген сигнализации исследования in vivo, но также могут быть применены к другим белкам, которые могут быть вовлечены в развитие колита.

Introduction

Болезнь Крона (CD) является воспалительным заболеванием кишечника (IBD) проявляется как хроническое воспаление кишечника. Этиология CD плохо понимается, но есть несколько основных факторов, которые, как представляется, несут ответственность за развитие компакт-диска, в том числе кишечной микробиоты, и генетические и экологические факторы, такие как диета или стресс1. Для лучшего понимания патогенеза болезни Крона, несколько моделей кишечного воспаления были использованы2,,3,,4,,5,,6,7. В этой статье мы представляем результаты, полученные из 2,4,6-тринитробензенсеновой сульфоновой кислоты (TNBS)-индуцированной модели murine CD.

Было документально подтверждено, что эстрогены способны модулировать хроническое воспаление кишечника8,9,10,11,12. Биологическая активность эстрогенов опосредованается cognate рецепторов, среди которых являются ядерные рецепторы эстрогена (ERs), т.е. ЭРЗ (ген ESR1) и Эр-Эра (ген ESR2), а также G13,14белка связанных рецепторов эстрогена, т.е., GPER (ген GPER1), называется Есть несколько методов для определения уровня рецепторов эстрогена, но лишь немногие из них могут быть использованы для визуализации их в кишечнике.

Иммуногистохимия (IHC) является широко используемым методом в клинических и базовых исследованиях для обнаружения определенных антигенов в клетках или тканях с флюорохром-конъюгированными антителами. IHC, как представляется, является важным методом в визуализации структуры тканей, а также в выявлении и локализации конкретных белков, которые могут иметь решающее значение для понимания развития колита. Здесь мы представляем полный и проверенный протокол для иммуногистохимической визуализации рецепторов эстрогена в кишечнике с использованием иммунофлуоресценции.

Protocol

Исследования на животных проводились с согласия Местного комитета по этике (28/29/2016) в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета от 22 сентября 2010 года и институциональными рекомендациями. 1. TNBS-индуцированной морин модели болезни Крона <p class="jove_conte…

Representative Results

Макроскопические характеристики толстой кишки у мышей с болезнью Крона, вызванной TNBSРепрезентативные изображения толстой кишки взяты из контроля и TNBS обработанных мышей показаны на рисунке 2. У мышей с TNBS-индуцированной модели болезни Кро?…

Discussion

Существует множество моделей животных для исследования ПАтофизиологии IBD, включая генетические, иммунологические или спонтанные модели, а также химически индуцированные модели15. Среди нескольких типов животных моделей колита, химически индуцированных моделей, таких как…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа была опубликована благодаря финансовой поддержке властей Лодзинского университета: проректора по научным исследованиям, проректора по национальному и международному сотрудничеству, декана факультета биологии и охраны окружающей среды. Damian Jacenik was supported by grants (2017/24/T/NZ5/00045 and 2015/17/N/NZ5/00336) from National Science Centre, Poland.

Materials

Animals
BALB/C mice University of Lodz NA
Equipment
Caliper VWR 62379-531
Cardboard block NA NA
Confocal microscope – TCS SP8 Leica Biosystems NA
Fully automated rotary microtome – RM2255 Leica Biosystems NA
Glass slide Thermo Scientific J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H Leica Biosystems NA
Histological box Marfour LN.138747
Hydrophobic pen Sigma-Aldrich Z377821
Laboratory balance Radwag WL-104-0048
LAS X software Leica Biosystems NA
Metal mold Marfour CP.5105
Sterile gauze NA NA
Sterile scissor NA NA
Sterile tweezer NA NA
Tissue processor – TP1020 Leica Biosystems NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid Sigma-Aldrich 92822
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3294
DiOC6 (3) Sigma-Aldrich 318426
DyLight 650 secondary antibody Abcam ab96886
ERα primary antibody Abcam ab75635
ERβ primary antibody Abcam ab3576
Ethanol Avantor Performance Materials Poland 396480111
Formaldehyde Avantor Performance Materials Poland 432173111
GPER primary antibody Abcam ab39742
Hydrochloric acid Avantor Performance Materials Poland 575283421
Hydrogen peroxidase Avantor Performance Materials Poland 885193111
isoflurane (forane) Baxter 1001936040
Normal goat serum Gibco 16210064
Paraffin Leica Biosystems 39602012
Petrie dish Nest Scientific 705001
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P3813
Physiological saline Sigma-Aldrich 7982
Primocin (antibiotic) Invitrogen ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) Invitrogen P36971
Sodium chloride Chempur WE/231-598-3
Sodium citrate Avantor Performance Materials Poland 795780429
Tris Avantor Performance Materials Poland 853470115
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Xylene Avantor Performance Materials Poland BA0860119

参考文献

  1. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
  2. Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  3. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  4. Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
  5. Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
  6. Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
  7. Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
  8. Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
  9. Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
  10. Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
  11. Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
  12. Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
  13. Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
  14. Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
  15. Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
  16. Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
  17. Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
  18. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).

Play Video

記事を引用
Jacenik, D., Zielińska, M., Michlewska, S., Fichna, J., Krajewska, W. M. Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn’s Disease using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (157), e60813, doi:10.3791/60813 (2020).

View Video