면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화
概要
이 프로토콜은 파라핀에 내장된 포르말린 고정 결장 섹션의 면역형광을 이용한 면역성 화학에 의한 에스트로겐 수용체의 시각화 방법 및 크론병의 완전한 검증된 TNBS 유도 뮤린 모델을 제시한다.
Abstract
크론병은 가장 진단된 염증성 장 질환입니다. 장에서 발전하는 만성 염증은 연동 무질서 및 장 점막의 손상으로 이끌어 내고 결장 신생물 변환의 증가한 리스크와 연관되는 것처럼 보입니다. 축적 된 증거는 에스트로겐과 에스트로겐 수용체가 호르몬에 민감한 조직뿐만 아니라 폐 또는 결장과 같은 에스트로겐과 직접 관련이없는 다른 조직에도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 여기서, 우리는 TNBS 유도 크론병의 뮤린 모델로부터 수득된 결장에서 에스트로겐 수용체의 성공적인 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 기술한다. 마우스와 장 제제에서 크론 병의 유도에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 내장 장 절편을 사용하여 단계별 면역 히스토미칼 절차가 제공됩니다. 기술된 방법은 생체 내에서 에스트로겐 수용체 검출 및 에스트로겐 신호 조사뿐만 아니라 대장염의 발달에 관여할 수 있는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.
Introduction
크론병(CD)은 만성 장염증으로 나타나는 염증성 장질환(IBD)입니다. CD의 병인은 제대로 이해되지 않지만, 장내 미생물, 식이 또는 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인을 포함하여 CD 발달을 담당하는 것으로 보이는 몇 가지 주요 요인이있다 1. 크론 병의 병인을 더 잘 이해하기 위해,장 염증의 여러 모델이2,3,43,5,56,7을사용했습니다. 본 문서에서, 우리는 CD의 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)-유도 된 뮤린 모델으로부터 얻은 결과를 제시한다.
에스트로겐은 만성 장 염증8,,9,10,,11,,12를변조 할 수 있다는 것이 문서화되었습니다.9 에스트로겐의 생물학적 활성은 핵 에스트로겐 수용체(ER), 즉 ERα(유전자 ESR1)및 ERβ(유전자 ESR2),G 단백질 결합 에스트로겐 수용체, 즉 GPER(유전자 GPER1)로지칭되는 핵 에스트로겐 수용체(ER)에 의해 매개된다.13,14 에스트로겐 수용체의 수준을 결정하는 몇 가지 방법이 있습니다, 하지만 몇 가지만 장에서 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
면역 조직화학(IHC)은 불소-컨쥬게이트 항체를 가진 세포 또는 조직에서 특정 항원검출을 위한 임상 및 기초 연구에서 널리 사용되는 방법이다. IHC는 대장염의 발달을 이해하는 것이 중요할 지도 모르다 특정 단백질의 식별 그리고 현지화에서 조직 구조 시각화에 있는 중요한 방법 일 것 같습니다. 여기에서, 우리는 면역형광을 사용하여 창자에 있는 에스트로겐 수용체의 면역성 화학적 시각화를 위한 완전하고 검증된 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
IBD 병리생리학 검사를 위한 수많은 동물 모델들이 있는데, 여기에는 유전적, 면역학적 또는 자발적인 모델뿐만 아니라 화학적으로 유도된모델(15)을포함한다. 대장염의 여러 동물 모델 중에서, 이 프로토콜에 기재된 TNBS 유도 모델과 같은 화학적으로 유도된 모델은 비교적 저렴하고 쉽게 얻을 수 있다. 대장염의 TNBS 유도 뮤린 모델은 CD의 병리학적 기초와 관련된 몇 가지 임상 증?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작품은 로츠 당국의 재정 지원 덕분에 출판되었다: 과학 연구를위한 부총장, 국가 및 국제 협력을위한 부총장과 생물학 및 환경 보호 학부의 학장. 다미안 제이스닉은 폴란드 국립과학센터의 보조금(2017/24/T/NZ5/00045 및 2015/17/Nz5/00336)을 지원받았습니다.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
参考文献
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