التعرف على مستقبلات سطح الخلية باستخدام شاشات CRISPR/Cas9 الجينية على مقياس الجينوم
概要
تصف هذه المخطوطة نهج فحص قائم على الخلايا على نطاق الجينوم لتحديد تفاعلات مستقبلات ligand خارج الخلية.
Abstract
الاتصال بين الخلايا بوساطة التفاعلات المباشرة بين مستقبلات سطح الخلية جزءا لا يتجزأ من الغشاء أمر بالغ الأهمية للتنمية العادية وعمل الكائنات متعددة الخلايا. ومع ذلك، لا يزال الكشف عن هذه التفاعلات يشكل تحدياً من الناحية الفنية. تصف هذه المخطوطة نهج فحص وراثي منهجي على نطاق الجينوم CRISPR/Cas9 بالضربة القاضية يكشف عن المسارات الخلوية المطلوبة لأحداث محددة للتعرف على سطح الخلية. يستخدم هذا الفحص البروتينات المؤتلفة المنتجة في نظام التعبير البروتيني الثديي كتحقيقات ملزمة متعطشا لتحديد شركاء التفاعل في شاشة وراثية تعتمد على الخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد الجينات اللازمة لتفاعلات سطح الخلية التي تم اكتشافها بواسطة تحقيقات الربط المؤتلفة المقابلة لectodomains من المستقبلات المضمنة في الغشاء. الأهم من ذلك، نظرا لطبيعة مقياس الجينوم من هذا النهج، كما أن لديها ميزة ليس فقط تحديد المستقبلات المباشرة ولكن أيضا المكونات الخلوية المطلوبة لعرض المستقبلات على سطح الخلية، وبالتالي توفير رؤى قيمة في بيولوجيا المستقبلات.
Introduction
التفاعلات خارج الخلية بواسطة البروتينات مستقبلات سطح الخلية مباشرة العمليات البيولوجية الهامة مثل تنظيم الأنسجة، والاعتراف المضيف الممرض، وتنظيم المناعة. إن التحقيق في هذه التفاعلات يهم المجتمع الطبي الحيوي الأوسع، لأن مستقبلات الأغشية هي أهداف قابلة للتنفيذ للعلاجات التي يتم تسليمها بشكل منهجي مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وعلى الرغم من أهميتها، لا تزال دراسة هذه التفاعلات صعبة من الناحية التقنية. ويرجع ذلك أساسا إلى أن المستقبلات المدمجة للأغشية هي مستقبلات أمبيباثية، مما يجعل من الصعب عزلها عن الأغشية البيولوجية للتلاعب بالمواد الكيميائية الحيوية، ويتم تصنيف تفاعلاتها من خلال تقارب التفاعل الضعيف(KDs في نطاق μM-mM)1. وبالتالي، العديد من الطرق الشائعة الاستخدام غير مناسبة للكشف عن هذه الفئة من التفاعلاتالبروتين1،2.
وقد وضعت مجموعة من الأساليب للتحقيق على وجه التحديد خارج الخلية مستقبلات ligand التفاعلات التي تأخذ خصائصها الكيميائية الحيوية فريدة من نوعها في الاعتبار3. وينطوي عدد من هذه النهج على التعبير عن كامل نطاق المستقبل كبروتين مؤتلف قابل للذوبان في النظم الثديية أو النظم القائمة على خلايا الحشرات لضمان احتواء هذه البروتينات على تعديلات ما بعد الترجمة ذات الأهمية الهيكلية، مثل الجليكان والروابط اللاكبريتيدة. للتغلب على الربط المنخفض التقارب ، وغالبا ما تكون oligomerized ectodomains لزيادة avidity ملزمة. وقد استخدمت بنجاح ectodomains البروتين متعطشا كتحقيقات ملزمة لتحديد شركاء التفاعل في الشاشات المباشرة التفاعل البروتين البروتيني المؤتلف4،5،6،7. في حين أن ناجحة على نطاق واسع, الأساليب القائمة على البروتين المؤتلف تتطلب أن يتم إنتاج ectodomain من مستقبلات غشاء كبروتين قابل للذوبان. لذلك ، فإنه ينطبق بشكل عام فقط على البروتينات التي تحتوي على منطقة متجاورة خارج الخلية (على سبيل المثال ، من النوع الأول أو النوع الثاني أو GPI الراسية) ولا يصلح بشكل عام لمجمعات المستقبلات وبروتينات الأغشية التي تمتد عبر الغشاء عدة مرات.
كما استخدمت تقنيات استنساخ التعبير التي يتم فيها نقل مكتبة من DNAs التكميلية (cDNAs) إلى الخلايا واختبارها للحصول على نوع ظاهري مربط لتحديد التفاعلات البروتينية والبروتينية خارج الخلية8. وقد سهل توافر مجموعات كبيرة من البلازميد التعبير cDNA المستنسخة وتسلسل في السنوات الأخيرة الطرق التي خطوط الخلايا التي تعبر بشكل مفرط cDNAs مستقبلات سطح الخلية ترميز يتم فحص لربط البروتينات المؤتلفة لتحديد التفاعلات9,10. المقاربات المستندة إلى التعبير المفرط cDNA، على عكس الأساليب المؤتلفة القائمة على البروتين، تتيح إمكانية تحديد التفاعلات في سياق غشاء البلازما. ومع ذلك، فإن نجاح استخدام بناء تعبير cDNA يعتمد على قدرة الخلايا على التعبير عن البروتين في شكل مطوية بشكل صحيح، ولكن هذا غالبا ما يتطلب عوامل التبعي الخلوية مثل الناقلين، المرافقين، والتجمع الأوليغوميريك الصحيح. وبالتالي فإن تحويل cDNA واحد قد لا يكون كافيا لتحقيق تعبير سطح الخلية.
تقنيات الفحص باستخدام بناء cDNA أو تحقيقات البروتين المؤتلف هي كثيفة الموارد وتتطلب مجموعات كبيرة من مكتبات البروتين cDNA أو المؤتلف. وقد استخدمت أساليب مصممة خصيصا الطيف الكتلي في الآونة الأخيرة لتحديد التفاعلات خارج الخلية التي لا تتطلب تجميع المكتبات الكبيرة. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات التلاعب الكيميائي لسطح الخلية ، والتي يمكن أن تغير الطبيعة الكيميائية الحيوية للجزيئات الموجودة على سطح الخلايا وتنطبق حاليًا فقط على التفاعلات التي تتوسطها البروتينات الغليكوزيلية11،12. معظم الطرق المتاحة حاليا تركز أيضا بشكل كبير على التفاعلات بين البروتينات مع تجاهل إلى حد كبير مساهمة من البيئة الدقيقة الغشاء، بما في ذلك جزيئات مثل الغليكان، والدهون، والكوليسترول.
وقد مكّن التطور الأخير للاستهداف الثنائي عالي الكفاءة باستخدام النهج القائمة على CRISPR مكتبات على نطاق الجينوم من الخلايا التي تفتقر إلى جينات محددة في تجمع واحد يمكن فحصه بطريقة منهجية وغير متحيزة لتحديد المكونات الخلوية المشاركة في سياقات مختلفة، بما في ذلك تشريح عمليات الإشارات الخلوية ، وتحديد الاضطرابات التي تمنح مقاومة للأدوية والسموم ومسببات الأمراض ، وتحديد خصوصية الأجسام المضادة13،14،15،16. هنا، نحن نصف فحص الخلايا القاضية على مقياس الجينوم CRISPR الذي يوفر بديلاً للنهج الكيميائية الحيوية الحالية لتحديد تفاعلات مستقبلات ligand خارج الخلية. هذا النهج لتحديد التفاعلات التي تتوسط ها من قبل مستقبلات الأغشية بواسطة الشاشات الوراثية هو مناسب بشكل خاص للباحثين الذين لديهم اهتمام مركز على ligands الفردية لأنه يتجنب الحاجة إلى تجميع مكتبات كبيرة من الـ cDNAs أو البروتينات المؤتلفة.
يتكون هذا الفحص من ثلاث خطوات رئيسية: 1) يتم إنتاج تحقيقات ملزمة للبروتين المؤتلف للغاية تتكون من المناطق خارج الخلية لمستقبلات الاهتمام وتستخدم في الاختبارات الملزمة القائمة على التدفق القائم على التدفق القائم على الفلورسينس. 2) وتستخدم المقالات ملزمة لتحديد خط الخلية التي تعبر عن شريك التفاعل من مسبار البروتين المؤتلف؛ 3) يتم إنتاج نسخة من خط الخلية التي تتفاعل مع البروتين المهم وشاشة خروج المغلوب CRISPR/Cas9 المستندة إلى مقياس الجينوم(الشكل 1). في هذه الشاشة الوراثية، يتم استخدام ربط البروتين المؤتلف بخطوط الخلايا كنوع ظاهري قابل للقياس يتم فيه فرز الخلايا داخل مكتبة خروج المغلوب التي فقدت القدرة على ربط المسبار باستخدام فرز الخلايا المنشطة المستندة إلى الفلورسينس (FACS) والجينات التي تسببت في فقدان النمط الظاهري الملزم الذي حدده التسلسل. من حيث المبدأ ، يتم تحديد الجينات ترميز المستقبلات المسؤولة عن ربط التحقيق متعطشا وتلك المطلوبة لعرض سطح الخلية.
الخطوة الأولى من هذا البروتوكول ينطوي على إنتاج تحقيقات البروتين المؤتلف متعطشا تمثل ectodomain من مستقبلات الغشاء ملزمة. ومن المعروف أن هذه المستقبلات للاحتفاظ في كثير من الأحيان وظائفها ملزمة خارج الخلية عندما يتم التعبير عن ectodomains كبروتين قابل للذوبان المؤتلف1. للحصول على بروتين ذو أهمية ، يمكن إنتاج البروتينات المؤتلفة القابلة للذوبان في أي نظام تعبير بروتين يوكاريوتيك مناسب في أي شكل شريطة أن يمكن أن يكون oligomerized لزيادة avidity ملزمة ، وأنه يحتوي على العلامات التي يمكن استخدامها في الاختبارات القائمة على التدفق القائم على الخلايا الفلورية القائمة على المقالات الملزمة (على سبيل المثال ، علامة العلم ، biotin – tag). بروتوكولات مفصلة لإنتاج ectodomains قابلة للذوبان من مستقبلات الأغشية باستخدام نظام التعبير البروتين HEK293، فضلا عن تقنيات متعددة مختلفة ويبني التعبير البروتين لإنتاج كل من البروتينات الخماسية والبروتينات أحادية اللون قد وصفت سابقا1،,17. سوف يصف البروتوكول هنا خطوات توليد المسابير الفلورية متعطشا من البروتينات الحيوية monomeric بالاقتران لهم إلى العقدية مترافق ة إلى الفلوروكروم (على سبيل المثال، phycoerythrin، أو PE)، والتي يمكن استخدامها مباشرة في الخلايا القائمة على الربط المقالات ولديها ميزة عدم الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية للكشف. وقد سبق وصف البروتوكولات العامة لأداء شاشات مقياس الجينوم20,21, وبالتالي فإن البروتوكول يركز بشكل رئيسي على تفاصيل أداء تدفق القائم على الخلايا المؤتلف ة البروتين المؤتلف ة شاشات الربط باستخدام نظام فحص خروج المغلوب CRISPR/Cas9 باستخدام 55 (“يوسا”) مكتبة18.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم وصف استراتيجية الفحص المستندة إلى CRISPR لتحديد الجينات ترميز المكونات الخلوية المشاركة في التعرف على الخلوية. كما يوفر نهج مماثل باستخدام تنشيط CRISPR بديلا ً جينياً لتحديد مستقبلات البروتينات المؤتلفة المتفاعلة بشكل مباشر دون الحاجة إلى إنشاء مكتبات بروتينكبيرة26. ومع ذلك ، فإن إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج هي أنه ينطبق على التفاعلات التي تتوسط فيها جزيئات السطح المعروضة في الأصل على الخلية ولا تعتمد على التعبير المفرط للمستقبلات ، والتي يمكن أن تؤثر على التفاني الملزم للمستقبلات. على عكس الطرق الأخرى ، لذلك ، لا تقدم هذه التقنية افتراضات بشأن الطبيعة الكيميائية الحيوية أو بيولوجيا الخلايا للمستقبلات وتوفر فرصة لدراسة التفاعلات التي تتوسط فيها البروتينات التي يصعب عادة دراستها باستخدام الأساليب الكيميائية الحيوية ، مثل البروتينات الكبيرة جدًا ، أو تلك التي تجتاز الغشاء عدة مرات أو تشكل مجمعات مع بروتينات أخرى ، وجزيئات أخرى غير البروتينات مثل الجليكان ، والدهون الجليكولوجية ، والفوسفوليبيدات. وبالنظر إلى طبيعة نطاق الجينوم للطريقة ، فإن هذا النهج له ميزة ليس فقط تحديد المستقبلات ولكن أيضًا المكونات الخلوية الإضافية المطلوبة للحدث الملزم ، وبالتالي توفير رؤى حول بيولوجيا الخلية للمستقبلات.
واحدة من القيود الرئيسية لهذه الطريقة عند استخدامها لتحديد مستقبلات البروتين اليتيم هو الشرط الأولي لتحديد خط الخلية الأولى التي ترتبط بالبروتين. هذا ليس من السهل دائماوتحديد خط الخلية التي تعرض النمط الظاهري ملزمة التي هي أيضا متساهلة للشاشات الوراثية يمكن أن تكون الخطوة التي تحدد الوقت لنشر هذا الفحص. بعض خطوط الخلايا تميل إلى ربط المزيد من البروتينات من غيرها. هذا هو ذات الصلة خاصة للبروتينات التي تربط HS، لأن هذه البروتينات تميل إلى ربط أي خط الخلية التي تعرض سلاسل الجانب HS، بغض النظر عن سياق الربط الأصلي. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا أن رفع تنظيم syndecans (أي البروتيوغليكانات التي تحتوي على HS) في خطوط الخلايا يؤدي إلى زيادة ربط البروتينات الملزمة HS26. قد يكون هذا عاملاً يجب أخذه في الاعتبار عند اختيار خط الخلية للفحص. ومع ذلك، من المهم أيضا أن نلاحظ أن الربط المضافة من HS لا تتداخل مع ملزمة لمستقبلات محددة. وهذا يعني أنه إذا لوحظ الربط، فمن الممكن أن يتم التوسط فقط من قبل HS لأن الربط بوساطة HS في هذا القول المضافة بدلاً من الاعتماد المشترك19. في مثل هذا السيناريو ، يمكن لنهج منع الهيبارين الموصوف تحديد مثل هذه السلوكيات دون الحاجة إلى إجراء شاشة جينية كاملة.
مورد مفيد لاختيار خطوط الخلية هو جواز سفر نموذج الخلية، الذي يحتوي على علم الجينوم، transcriptomics، ومعلومات حالة الثقافة ل ~ 1000 خطوط الخلايا السرطانية27. اعتمادا على السياق البيولوجي، يمكن اختيار الخلايا على أساس ملامح التعبير الخاصة بهم. للمساعدة في اختيار خطوط الخلية ، قمنا بتجميع ~ 1000 خط خلية في جواز سفر نموذج الخلية وفقًا للتعبير عن ~ 1500 بروتينات سطح الخلية البشرية المبوطة28 (الشكل التكميلي 2؛ يتم توفير معلومات الكتلة لكل خط خلية مع ظروف النمو في الجدول التكميلي 2). عند اختبار ربط بروتين مع وظيفة غير معروفة، فمن المفيد لتحديد لوحة من خطوط الخلية التمثيلية من كل مجموعة لزيادة فرصة تغطية مجموعة واسعة من المستقبلات. نظرا للاختيار، فمن المستحسن لاختيار خطوط الخلية التي هي سهلة للثقافة وسهلة لtransduce. وبما أن خطوط الخلايا هذه ستستخدم في الفحص على نطاق الجينوم، فمن الأفضل أن تزرع بسهولة بكميات كبيرة وتكون متساهلة مع نقل الفيروس، لأنها الطريقة الأكثر شيوعاً المتاحة لتسليم sgRNA للفحص الجيني القائم على CRISPR في الخطوات اللاحقة.
بشكل عام، يتم تنفيذ تحديدات النمط الظاهري في فرز واحد. ومع ذلك ، يتم تحديد هذا من خلال سطوع عدد الخلايا الملطخة مقارنة بعنصر التحكم. ويمكن اعتماد جولات تكرارية من التحديدات للسيناريوهات التي تكون فيها نسبة الإشارة إلى الضوضاء في النمط الظاهري المطلوب منخفضة، أو عندما يكون الهدف من الشاشة هو تحديد المسوخ التي لها أنماط ظاهرية قوية. عند استخدام نهج الاختيار التكراري للشاشات المستندة إلى FACS ، من المهم اعتبار أن عملية الفرز يمكن أن تسبب موت الخلايا ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى القوة المطلقة للفرز. وبالتالي، لن يتم تمثيل جميع الخلايا التي تم جمعها في الجولة التالية من الفرز.
تعقيد المكتبة هو عامل مهم جدا في أداء الشاشات الوراثية الناجحة، وخاصة بالنسبة لشاشات الاختيار السلبية لأن مدى الاستنفاد في هذه لا يمكن تحديده إلا من خلال مقارنة النتائج بما كان موجودا في مكتبة البداية. بالنسبة لشاشات التحديد السلبية، من الشائع الحفاظ على مكتبات بتعقيد 500-1000 x. ومع ذلك، فإن شاشات الاختيار الإيجابي أكثر قوة لأحجام المكتبات، لأنه في مثل هذه الشاشات لا يتوقع اختيار سوى عدد صغير من المسوخ لنوع ظاهري معين. لذلك ، في شاشة التحديد الإيجابي الموضحة هنا ، يمكن تقليل حجم المكتبة إلى تعقيد 50-100x دون المساس بجودة الشاشة. بالإضافة إلى ذلك ، في هذه الشاشات من الممكن أيضًا استخدام مكتبة تحكم لخط خلية معين في يوم معين كـ “عنصر تحكم عام” لجميع العينات التي تم فرزها في اليوم لهذا الخط الخلوي المحدد. سيؤدي ذلك إلى تقليل عدد مكتبات التحكم التي تحتاج إلى إنتاجها وتسلسلها.
ومن الاعتبارات الهامة الأخرى لاستخدام هذا النهج القيود المفروضة على شاشات فقدان الوظيفة في تحديد الجينات الضرورية لنمو الخلايا المختبرية. توقيت الشاشات أمر بالغ الأهمية في هذا الصدد ، حيث كلما طالت الخلايا المتحولة في الثقافة ، كلما زاد احتمال أن تصبح الخلايا ذات الطفرات في الجينات الأساسية غير قابلة للحياة ولم تعد ممثلة في المكتبة المتحولة. الشاشات الوراثية الأخيرة التي أجريت كجزء من مبادرة نقاط المشروع في أكثر من 300 خطوط الخلايا تظهر أن الجينات المتعددة في إفراز البروتين المشروح KEGG ومسار N-glycosylation غالبا ما يتم تحديدها على أنها ضرورية لعدد من خطوط الخلايا(الشكل التكميلي 3)29. ويمكن أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند تصميم الشاشات إذا كان تأثير الجينات المطلوبة للانتشار والجدوى هو التحقيق في سياق عملية التعرف على الخلايا. وفي هذه الحالة، يكون من المناسب عموماً تنفيذ الشاشات في وقت مبكر (على سبيل المثال، اليوم 9 بعد النقل). ومع ذلك، إذا تم استخدام النهج لتحديد عدد قليل من الأهداف ذات الآثار القوية الحجم بدلاً من المسارات الخلوية العامة، فقد يكون من المناسب إجراء الشاشات في وقت لاحق (على سبيل المثال، اليوم 15-16 بعد النقل).
نتائج الفحص قوية جداً. في ثماني شاشات ربط البروتين المؤتلف أجريت في الماضي، وكان مستقبلات سطح الخلية ضرب أعلى في كل حالة19. عند استخدام هذا النهج لتحديد شريك التفاعل، ينبغي للمرء أن يتوقع لذلك المستقبلات والعوامل التي تسهم في عرضه على السطح أن يتم تحديدها مع ثقة إحصائية عالية. بمجرد تنفيذ الشاشة والتحقق من صحة ضرب باستخدام ضربة قاضية gRNA واحدة، يمكن إجراء المزيد من المتابعة باستخدام الأساليب الكيميائية الحيوية القائمة مثل AVEXIS4 والربط المباشر قابل للإشباع من البروتينات النقية باستخدام صدى البلازمون السطحي. النهج الموصوف هنا ينطبق على جميع البروتينات التي من الممكن توليد مسبار ملزم قابل للذوبان.
باختصار ، هذا هو نهج خروج المغلوب CRISPR على نطاق الجينوم لتحديد التفاعلات التي تتوسط ها من قبل البروتينات سطح الخلية. تنطبق هذه الطريقة بشكل عام لتحديد المسارات الخلوية اللازمة للتعرف على سطح الخلية في مجموعة واسعة من السياقات البيولوجية المختلفة، بما في ذلك بين خلايا الكائن الحي نفسه (مثل التعرف العصبي والمناعة)، وكذلك بين الخلايا المضيفة والبروتينات المسببة للأمراض. توفر هذه الطريقة بديلاً جينياً للنهج البيوكيميائية المصممة لتحديد المستقبلات، ولأنها لا تتطلب أي افتراضات مسبقة فيما يتعلق بالطبيعة الكيميائية الحيوية أو بيولوجيا الخلايا للمستقبلات، فإن لديها إمكانات كبيرة لتحقيق اكتشافات غير متوقعة تماماً.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل منحة ويلكوم تراست رقم 206194 الممنوح لشركة GJW. نشكر منشأة Cytometry Core: Bee Ling Ng ، جنيفر غراهام ، سام طومسون ، وكريستوفر هول للمساعدة في FACS.
Materials
| Anti-mouse alkaline phosphatase | Sigma | A4656 | |
| Blasticidin | Chem-Cruz | SC-204655 | |
| Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit | Qiagen | 13362 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| Diethanolamine | Sigma | 398179 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | |
| Dneasy Blood and Tissue kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag-96 Side Magnet | Invitrogen | 12331D | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heparin | Sigma | H4784-1G | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa | KK2602 | |
| Lipofectamine LTX with PLUS reagent | Invitrogen | 15338100 | |
| MoFlo XDP cell sorter | BD | ||
| Ni2+-NTA agarose beads | Jena Bioscience | AC-501-25 | |
| OPTI-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| OX-68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 1040-506 | |
| PD-10 desalting columns | GE healthcare | 17085101 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Polypropylene tubes with 5 mL bed volume | Qiagen | 34964 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 3115879001 | |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix | NEB | M0494L | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| SCFA filter | Nalgene | 190-2545 | |
| Sony Cell sorter | Sony | ||
| SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) | Beckman | A63881 | |
| Streptavidin-coated microtitre plates | Nalgene | 734-1284 | |
| Streptavidin-PE | Biolegend | 405204 |
参考文献
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions. Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).
- Wood, L., Wright, G. J. Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions. Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).
- Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Visser, J. J., et al. An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina. eLife. 4, e08149 (2015).
- Özkan, E., et al. An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks. Cell. 154 (1), 228-239 (2013).
- Martinez-Martin, N., et al. An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor. Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).
- Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).
- Mullican, S. E., et al. GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates. Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).
- Turner, L., et al. Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor. Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).
- Frei, A. P., et al. Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues. Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).
- Sobotzki, N., et al. HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands. Nature Communications. 9 (1), 1519 (2018).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions. Viruses. 10 (2), (2018).
- Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library. Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).
- Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. A CRISPR toolbox to study virus-host interactions. Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).
- Kerr, J. S., Wright, G. J. Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions. Journal of Visualized Experiments. (61), e3881 (2012).
- Tzelepis, K., et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).
- Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition. Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).
- Wang, B., et al. Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute. Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).
- Crosnier, C., et al. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).
- Kirk, P., et al. CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression. The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).
- Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation. Genome Biology. 19 (1), 205 (2018).
- van der Meer, D., et al. Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models. Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PloS One. 10 (3), e0121314 (2015).
- Behan, F. M., et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).
