게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

1. 생체태깅 단백질의 생산 및 정제 포유류 또는 곤충 세포 계 단백질 발현 시스템을 사용하여 수용성 재조합 그의 태그가 붙은 생체 면역 단백질을 생성한다(표 1의플라스미드 구성 참조).참고: HEK293 세포 발현 시스템을 사용하여 단모성 비오틴 및 그의 태그가 붙은 단백질의 생산을 위한 상세한 프로토콜은 Kerr et al.17에의해 설명된다. HEK293 발현 시스템을 사용하여 발현된 단백질 ectodomains는 배양 배지 내로 분비된다. 수용성 단백질을 3,000 x g에서 원심분리하여 20분 동안 펠릿하여 수집합니다. 0.22 μm 필터를 통해 상류체를 걸러내고 Ni2+-NTA 아가로즈 비드를 여과된 단백질 상층부액에 1:1,000 비율로 첨가합니다(즉, 50% 아가로즈 슬러리를 50 mL의 상복부에) 회전 플랫폼에서 4°C에서 하룻밤 또는 적어도 4-5시간 배양한다. 폴리프로필렌 컬럼을 5 mL의 정화 세척 버퍼를 추가하여 세척합니다. 모든 버퍼 컴포지션에 대한 표 2를 참조하십시오. 전체 비드-단백질 상급 혼합물을 컬럼에 붓습니다. 구슬은 기지에 축적됩니다. 15 mL의 세척 버퍼로 구슬을 2 x 씻으하십시오. 단백질 희석을 방지하려면 5 mL 주사기로 컬럼에서 잔류 세척 버퍼를 조심스럽게 그려 버리고 폐기하십시오. 조심스럽게 구슬에 직접 자신의 정제 용출 완충제의 300-500 μL을 추가하고 적어도 1 시간 동안 배양. 1 mL 주사기를 사용하여 액체를 다시 조심스럽게 뽑아 서 용출 된 단백질을 수집합니다. 용출 버퍼를 탈염 컬럼을 사용하여 원하는 버퍼(예: 일반적으로 PBS 또는 HBS)로 교환합니다. 모든 단백질을 4°C에서 추가로 사용할 때까지 보관하십시오. 2. 단모성 생체 면역 단백질의 정량화 및 올리고머화 참고 : 결합 열력을 높이기 위해, 결합 검충에 사용하기 전에 tetrameric 연쇄상 구균 -PE에 생체 면역 화된 단일 성 단백질을 올리고 메리화. 단면성 단백질과 테트라메릭 스트렙타비딘-PE의 최적 접합 비를 달성하여 고정 된 농도의 스트렙타비딘에 대해 생물질화 단량체의 희석 시리즈를 테스트하고 경험적으로 과도한 생체 티니제 단량체가 검출될 수 없는 최소 희석을 확립합니다. 적절한 희석 완충제(1% 소 혈청 알부민[BSA]를 가진 PBS 또는 HBS)를 사용하여 생체 질화된 단백질 샘플의 적어도 8개의 직렬 희석을 96웰 플레이트에 확인합니다. 각 희석의 최종 부피가 200 μL 이상인지 확인합니다. 각 우물에서 100 μL을 제거하고 새로운 96 웰 플레이트로 옮겨 샘플의 중복 플레이트를 만듭니다. 항상 컨트롤을 포함합니다. 이 경우 대조군(즉, 생체티니제화된 Cd4 도메인 3+4 단백질)이 태그 전용 단백질이다. 이것은 모든 결합 검매에서 대조군 프로브로서 사용될 것이다. 희석 완충액에서 스트렙타비딘-PE를 0.1 μg/mL로 희석한다. 접시 중 하나에 희석 된 스트렙타비딘 -PE 100 μL을 추가하십시오. 중복 플레이트는 컨트롤역할을 합니다. 100 μL의 희석 버퍼를 제어 판에 추가하여 볼륨을 균등화합니다. 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다. 그 동안, 15 분 동안 희석 버퍼로 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 우물을 차단합니다. 두 플레이트에서 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 개별 우물로 샘플의 총 부피를 전송하고 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 플레이트를 200 μL의 세척 버퍼로 3x 세척하십시오 (즉, 0.1 % 트웬-20, 2 % BSA로 PBS 또는 HBS). 2 μg/mL 마우스 안티 래트 Cd4d3+4 IgG(OX68)의 100 μL을 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 플레이트를 3x 세척합니다. RT에서 1시간 동안 0.2 μg/mL에 항마우스 알칼리성 인산염 컨쥬게이트 100 μL을 첨가합니다. 세척 버퍼로 플레이트를 3x, 희석 버퍼에서 1x로 세척합니다. 디에탄올아민 완충제에서 1 mg/mL에서 p-니트로페닐 인산염을 준비합니다. 각 우물에 100 μL을 넣고 15 분 동안 배양하십시오. 405 nm에서 흡광도 판독값을 가져 가라. 테트라머를 생성하기 위한 적절한 희석 계수로서 플레이트에 신호가 없는 최소 희석을 사용하십시오(그림2). 4 μg/mL 스트렙타비딘-PE와 30분 동안 적절한 생체티니얼 단백질 희석을 인큐베이팅하여 모든 시료 및 대조군을 위한 10x 테트라머 염색 용액을 RT. Store 에서 4°C의 광 보호 튜브에 공액 단백질을 추가 사용하십시오. 3. 유세포 분석 계 세포 결합 분석 부착 세포의 경우 배양 매체를 제거하고 DIVALENT 양이온없이 PBS로 1x를 씻으하십시오. 그런 다음 셀 분리 솔루션(예: EDTA)을 추가합니다. 세포가 5-10 분 동안 분리되도록 하십시오.참고: 트립신 기반 제품은 세포 표면 단백질을 갈라놓을 수 있기 때문에 사용하지 마십시오. 분리된 세포를 튜브에 모읍시다. 현탁액에서 성장하는 세포의 경우(예를 들어, HEK293 세포), 배양 플라스크로부터 직접 튜브내로 세포를 수집한다. 펠릿 세포는 5분 동안 200 x g에서 상류를 제거하고 펠릿을 세척 완충제(즉, PBS/1% BSA)에 다시 놓습니다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산하고 농도를 2.5 x 105 -1x 106 세포 /mL로 조정합니다. 96 개의 웰 U-또는 V-바닥 플레이트상에 제조된 셀 믹스의 Aliquot 100 μL. 400 x g에서5 분 동안 접시를 돌이기 . 멀티채널 파이펫으로 상급체를 제거합니다. 정규화된 형광성 으로 표지된 100 μL을 세포가 있는 이전에 준비된 플레이트에 넣고 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 1 시간 동안 바인딩 한 후 400 x g에서 5 분 동안 플레이트를 돌이꿉습니다. 상급체를 제거하고 세척 버퍼 200 μL(즉, PBS/1% BSA)를 추가합니다. 위아래로 파이펫팅하여 잘 섞으세요. 400 x g에서 원심분리하여 세포를 5분 동안 펠렛합니다. 2번의 세안 후, 상류자를 완전히 제거하고 100 μL의 PBS에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다. 유세포측정으로 세포를 분석합니다. 노란색-녹색 레이저(즉, 561 nm)를 사용하여 PE 형광을 검출합니다. 먼저 제어 프로브로 염색된 세포를 분석합니다. PE 형광의 분포에 기초하여, 제어 셀의 1% 이상이 이 게이트에 빠지지 않는 등 결합 집단에 대한 게이트를 그립니다. 샘플을 분석하고 결합 게이트에 속하는 셀의 분율을 결정합니다.참고: 더 높은 결합 인구를 표시하는 세포주는 더 높은 신호 대 잡음 비율을 갖기 때문에 유전 스크린을 위해 요구됩니다. 이상적으로 세포의 80% 이상이 이 문 안에 있어야 합니다. 4. 열 비질 에피토프 및 헤파란 황산염 사이드체인의 결합 기여도 결정 참고 : 많은 단백질의 활성은 열 불안정, 그래서 열처리 다음 바인딩 활동의 손실은 고무적이다. 재조합 단백질의 결합을 중재하는 데 부정적인 전하 글리코사미노 글리칸, 주로 헤파란 황산염 (HS)의 기여도를 결정하는 것이 좋습니다. 이는 여기에 기재된 세포 결합 분석에서 HS에 의한 결합이 다른수용체(19)에동의존적이지 않고 첨가제가 될 수 있기 때문이다. 이는 관찰된 결합이 특정 수용체에 의해서가 아니라 세포 표면 프로테오글리칸의 HS 측사슬에 의해 완전히 매개될 수 있음을 의미한다. 세포 표면상에서 HS에 결합하는 것은 반드시 비특이적일 필요는 없으며, 오히려 단백질의 성질이며, 이는 완전한 유전적 스크린을 수행하기 전에 아는 것이 유용하다. 결합 검정에 사용하기 위하여 열처리한 단백질 견본을 준비하십시오. 정규화되었지만 비콩액성 단조 단백질을 80°C에서 10분 동안 가열합니다. ELISA에 의해 결정된 것과 동일한 접합비를 가정하여 스트렙타비딘-PE에 열처리 된 단백질을 접합합니다 (섹션 2 참조). 헤파린으로 막힌 단백질 샘플을 준비합니다. 2 mg/mL의 시작 농도와 100 μL의 최종 부피로 PBS에서 수용성 헤파린 8개를 1:3 희석합니다. 헤파린 희석물에서 제조된 결합 프로브의 100 μL을 적어도 30분 동안 인큐베이트한다. 열처리된 단백질과 섹션 3에 기재된 결합 분석법에서 헤파린/단백질 혼합물의 전체 200 μL을 사용하십시오. 대표적인 결과는 그림 3A, B에나와 있습니다. 5. 안정적으로 Cas9를 표현하는 세포주 선택 참고: 관심 있는 프로브를 결합하는 세포주가 CRISPR 스크리닝에 사용될 수 있기 전에, 먼저 Cas9 뉴클레아제 및 고활성클론선택(19)을발현하도록 설계되어야 한다. Cas9 발현에 대한 렌티바이러스 구제를 사용하여 렌티바이러스를 생산하기 위해 다음의 일반적인 렌티바이러스 생산 프로토콜을 사용한다(표 1참조). 37°C 및 5%CO2에서DMEM/10% FBS 배지에서 배양 HEK293-FT 세포. 종자 HEK293-FT 세포는 형질전환 1일 전에 형질전환 당일 ~80% 수렴되도록 하였다.참고 : HEK293FT 세포는 느슨하게 부착됩니다. 따라서 렌티바이러스 생산에 사용될 때 순응도를 높이기 위해 0.1 % (w / v) 젤라틴으로 코팅 된 배양 플라스크에 도금을하는 것을 고려하십시오. 아침에 형질 전환을 수행합니다. 전사 벡터, 패키징 믹스 및 트랜스펙션 시약을 미리 온화된 트랜스펙션 호환 매체(예: Opti-MEM)에 추가합니다. 튜브를 10-15x 반전시켜 섞는다. RT에서 5분 동안 인큐베이팅하십시오. Table 3 제조업체에서 제안한 대로 형질감염 시약을 추가합니다. 빠른 소용돌이로 섞으세요. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 매우 신중하게 소비 매체를 흡인. 플레이트에 트랜스펙션 호환 용지를 추가합니다. 형질감염 시약/DNA 복합체를 플레이트 측면에 떨어뜨리고 매우 부드럽게 소용돌이치면서 플레이트를 통해 천천히 퍼집니다. 3-5 h에 대해 37 °C에서 배양하고 배지를 D10 배지로 대체합니다. 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음날 아침에 는 매체를 신선한 D10 매체로 교체하십시오. 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음날 오후 늦게, 바이러스 성 상한자를 수집하십시오. 단백질 결합이 낮은 0.45 μm 필터로 걸러내. 선택적으로, 신선한 D10 배지를 추가하고, 밤새 배양하고 다음날 상급을 회수하십시오. 바이러스 상피제는 며칠 동안만 4°C에서 안정하다. 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관하십시오.참고 : 세포를 변환하기 어려운 의 전이에 바람직 할 수있는 고농축 렌티 바이러스 제제를 생성하기 위해, 초자연자는 또한 4 °C에서 하룻밤 6,000 x g에서 원심 분리에 의해 집중 될 수있다. 에탄올 내성 펜으로 반투명 바이러스 성 펠릿을 표시하고 상한제를 버립니다. 농도가 100배 증가하기 위해 원래 부피의 1/100에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 렌티 바이러스로 세포를 변환합니다. 플레이트 1 x 106 세포를 6 웰 플레이트에서 3 mL의 적절한 배양 배지를 갖는다. 일부 세포는 다른 세포보다 더 쉽게 변환됩니다. 세포(예: HEK 세포)를 쉽게 변환하기 위해 렌티바이러스를 세포에 직접 추가하십시오. 세포를 변환하기 어려운 경우, 아래에 설명된 바와 같이 척추 분석 프로토콜을 따라야 할 수도 있습니다. 15 mL 원엽 튜브에서 2-5 x 106 세포 / mL의 2 mL. 렌티바이러스를 8 μg/mL 헥사디메트린 브로마이드와 함께 넣고 RT에서 30분 동안 배양합니다. 32 °C에서 800 x g에서 100 분 동안 원심 분리기. 그런 다음 동일한 배지에서 세포를 다시 중단하고 적절한 배지를 가진 적절한 배양 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다. 적어도 24 시간 동안 환관을 허용하십시오. 그 후 바이러스를 포함하는 매체를 제거하고 신선한 매체를 추가하십시오. 또 다른 24 시간 후, 적절한 항생제로 보충되는 것으로 미디어를 변경하십시오. Cas9 구성에는 선택을 위한 블라스카디딘 저항 카세트가 포함되어 있습니다.참고: 배스티치딘의 양은 투여량 응답 킬 곡선을 수행하여 각 세포주에 대해 최적화되어야 합니다. 2.5-50 μg/mL 사이의 블라스타시딘 농도는 트랜스덕트 10일 이내에 대부분의 전이되지 않은 세포주를 죽여야 합니다. 대조판에 있는 모든 세포(즉, 동일한 선택 항생제 농도로 처리된 비트랜스듀베이션 세포)가 죽을 때까지 선택을 수행한다. 6. 높은 Cas9 활동 클론 선택 참고 : 폴리 클로날 Cas9는 성공적으로 유전 스크린을 수행하는 데 사용할 수 있습니다; 그러나, 높은 Cas9 활성을 가진 클론을 선택하면 스크리닝 결과가18향상된다. 희석 또는 단세포 정렬 개별 블라스치디딘 내성 세포를 블라스티딘으로 보충된 배양 배지를 함유하는 3개의 96웰 플레이트의 우물로 제한사용. 클론은 2-4 주 사이에 등장하기 시작합니다. 10-20개의 클론을 선택하고 6개의 웰 플레이트로 확장합니다. 빠른 평가 GFP-BFP(녹색 형광 단백질-청색 형광 단백질) 시스템을 사용하여 Cas9 활성에 대한 클론을 분석하는 것은 세포가 gRNA 표적화 GFP 또는 빈 gRNA를 대조군으로 GFP를 발현하는 구성으로 변환되는 외인성 유전자 녹아웃 시스템을 사용하는18. 주문 리포터 플라스미드: GFP-BFP 플라스미드, 컨트롤-BFP 플라스미드(표 1). 섹션 5.1에 기재된 렌티바이러스 생산 프로토콜을 사용하여 GFP-BFP 플라스미드 및 대조군-BFP 플라스미드 모두에 대한 렌티바이러스를 생산한다. GFP-BFP 시스템 및 제어-BFP를 별도로 인코딩하는 렌티바이러스로 각 Cas9 발현 세포주 클론을 트랜스듀싱한다. 섹션 5.2의 프로토콜을 따르십시오. 3일간의 환전 후, 유세포측정을 사용하여 각 클론의 GFP-BFP 형광을 검사한다. 488 nm 레이저와 405 nm 레이저를 사용하여 GFP와 BFP를 각각 검출하십시오. GFP-BFP-이중 양성 세포에 대해서만 BFP의 비율을 조사하여 각 클론에서 Cas9 활성을 정량화한다. 높은 활성 Cas9 세포는 이상적으로 >95% GFP 녹아웃 효율을 가져야 한다(그림 4). 7. 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크리닝 녹아웃 라이브러리 생성 인간 V1라이브러리(18)를이용한 게놈 전체 스크리닝의 경우, 게놈 폭 라이브러리(표 1참조)를 주문하고 제조자 매뉴얼의 “라이브러리 복제를 위한 프로토콜”에 제공된 프로토콜을 사용하여 박테리아 스탭으로부터 플라스미드 라이브러리를 제조한다. 섹션 5.1에 기재된 렌티바이러스 생산 프로토콜을 사용하여 인간 유전자의 표적 중단에 대한 gRNA를 코딩하는 렌티바이러스 라이브러리를 생성하기 위해 게놈 전체 라이브러리 플라스미드 제제를 사용한다.참고 : 좋은 방법은 실험 일관성을 개선하기 위해 전염에 최적화 된 렌티 바이러스 제제의 단일 배치를 생산하는 것입니다. 섹션 5.2의 트랜스덕션 프로토콜을 사용하여 소규모 테스트 변환을 수행하여 각 세포주마다 필요한 바이러스 양을 결정하여 30% 트랜스덕션을 달성합니다. 유세포 측정을 사용하여 BFP 형광을 형광 효율의 프록시로 평가합니다. HEK293 세포를 트랜스듀싱하기 위해, 30-50 x 106 세포에 미리 정해진 렌티바이러스 제제를 첨가하여 ~4시간 동안 정상 성장 배지에서 배양하였다. 그런 다음 렌티바이러스로 미디어를 제거하고 신선한 성장 매체로 교체하십시오. 다른 세포주의 경우, 섹션 5.2.1에서 척추 분석 프로토콜을 사용하지만 더 큰 규모로 총 30-50 x 106 개의 셀이 변환되도록합니다. 이를 위해, 15 mL 원추형 튜브에서 5 x 106 세포/mL의 2 mL을 aliquot하고 지시된 대로 진행한다. 부착 된 세포주, 변환 후 puromycin 24 h를 추가하여 변환 된 세포를 선택합니다.참고: 용량 응답 킬 곡선을 수행하여 푸로마이신 농도를 최적화합니다. 일반적으로 1-10 μg/mL 사이의 농도는 3-5 일 이내에 비 트랜스 듀스 세포를 죽여야합니다. 이 하나 이상의 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 의해 변환 된 세포를 선택의 기회를 증가 시킬 수 있기 때문에 puromycin의 높은 농도 사용 하지 마십시오. 현탁액 세포의 경우, 수확형(즉, BFP 양성) 세포는 세포 선별기를 사용하여 3일 후 트랜스덕트 및 적어도 10 x 106 세포를 포함하는 라이브러리를 생성한다. 일단 BFP를 사용하여 선택되면, 적당한 양의 퓨로마이신을 보충한 매체에서 세포를 성장시다.참고: 세포 분류를 방해할 수 있는 현탁액 세포 배양물에서 죽은 세포와 이물질을 제거하기가 어렵기 때문에 현탁액 세포주에 대해서만 puromycin을 사용하여 선택을 피하십시오. 배양 돌연변이 라이브러리 9-16 일 동안 장시간 2-3 일마다 일반 통로로 전이 후. 8. 세포 표면 결합을 위한 유전 검열 돌연변이 세포 라이브러리를 200 x g에서 5분 동안 펠렛하고 PBS에서 세포를 다시 중단시켰다. 각 튜브에 적어도 50 x 106 셀을 가진 2개의 15 mL 원엽 관으로 세포를 분할합니다. 원뿔형 튜브 1개를 200 x g에서 5분 동안 돌리고 상한체를 제거하고 세포 펠릿을 -20°C에서 동결시.합니다. 이것은 제어 채우기이며 나중에 처리됩니다. PBS/1% BSA의 10 mL에서 다른 튜브에 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 96 웰 플레이트에 음성 대조군으로 세포의 100 μL을 따로 둡니다. 원추형 튜브 및 음성 대조군 단백질을 96웰 플레이트에 세포 현탁액에 적절한 preconjugated 재조합 단백질을 첨가한다. 부드러운 회전 (6 rpm)와 벤치 탑 로터에 4 °C에서 적어도 1 시간 동안 세포 염색을 수행합니다. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 펠렛하고 상류를 제거하십시오. 두 번의 세척 단계를 수행한 다음 5 mL의 PBS에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 세포 클러스터를 제거하기 위해 30 μm 세포 스트레이너를 통해 세포를 변형시. 흐름 선별기를 사용하여 분석합니다. BFP+/PE-셀에 대한 게이트에 음의 제어 샘플을 사용합니다. 샘플을 정렬하고 BFP+/PE-셀을 수집합니다. 정렬 게이트는 단백질에 대한 세포의 결합에 의존하지만 일반적으로 PE 음성 샘플의 1-5 %가 수집됩니다. 정렬 게이트의 예는 추가 그림 1에제공됩니다. 선택한 게이트에서 500,000-1,000,000셀을 수집합니다. 적은 수의 세포를 감안할 때, 손실을 최소화하기 위해 1.5 mL 원심분리관에서 샘플을 수집하는 것이 좋습니다. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 분류 된 세포를 펠렛하십시오. 펠릿을 최대 6개월 동안 -20°C에 보관할 수 있습니다. 9. GRNA 농축을 위한 게놈 DNA 추출 및 첫번째 PCR 고복잡성 조절 집단에서 게놈 DNA를 추출합니다. 대조군이 -20°C에서 동결된 경우, 원엽 튜브를 꺼내 PBS를 첨가한다. 펠릿을 해동하기 위해 얼음에 보관하십시오. 50 x 106 세포에서 게놈 DNA를 추출하기 위해 제조업체의 권장 사항을 사용하여 상업용 키트(재료 표참조)를 사용합니다. DNA 농도를 1 mg/mL로 조정합니다. 각 샘플에 대해 72 μg의 DNA에 해당하는 PCR에 대한 마스터 믹스를 설정합니다. Aliquot 50 μL 웰 당 36 웰 의 96 웰 PCR 플레이트. 필요한 프라이머 서열은 표 4에나열되어 있습니다. 표 5 및 6의가이드를 사용합니다. 6-12개의 대표적인 샘플에서 2%(v)의 아가로즈 젤로 PCR 5 μL을 해결합니다. ~ 250 bp에서 단일 명확한 밴드를 관찰해야한다. 밴드가 희미한 경우 PCR을 추가로 2-3주기 동안 반복합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰(총 180 μL)에서 5μL의 PCR 제품을 수집하고 상업용 키트에서 900 μL의 바인딩 버퍼가 있는 저장소에 풀링합니다(재료 표참조). 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 상용 키트로부터 50 μL의 용출 완충액으로 DNA를 용출하고(재료 표참조) DNA 농도를 측정합니다. 결합 표현형의 손실을 위해 분류된 견본은 독립적인 클론의 다수로 구성될 확률이 낮습니다. 따라서 72 μg의 DNA로 PCR을 수행 할 필요가 없습니다. 적절한 상용 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다(재료 표참조). 100 ng/μL DNA로 전에 기술된 프로토콜(섹션 9.1.3)을 사용하여 3-4개의 PCR 반응을 설정합니다. 정렬된 세포 수가 100,000 미만이면 게놈 DNA 제제 대신 세포 용해를 사용한다. Aliquot 약 10,000 세포 /잘 96 잘 PCR 플레이트에. 접시에 세포를 펠렛하고 조심스럽게 상류물의 대부분을 제거합니다. 펠릿이 표시되지 않습니다. 각 우물에 25 μL의 물을 넣고 샘플을 95°C에서 10분 동안 가열합니다. 5 μL 의 2 mg/mL 갓 희석된 단백질나아제 K를 각각 1시간 동안 잘 넣고 56°C에서 배양합니다. 그런 다음 95°C에서 10분 동안 샘플을 가열하여 단백질Ase K를 비활성화합니다. PCR 반응당 세포 용해수분 혼합물 10 μL을 사용하십시오. 용해제는 24 시간 이내에 사용해야합니다. 10. 인덱스 바코드 및 시퀀싱을 위한 두 번째 PCR 라운드 첫 번째 라운드 PCR에서 40 pg/μL로 제품을 희석합니다. 샘플당 하나의 PCR을 설정합니다(표 7 및 8에제공된 가이드 사용). 고충실도 폴리머라제의 사용은 sgRNA 증폭 동안 중합효소에 의해 유입되는 오류를 최소화하는 데 중요하다. 아가로즈 젤을 2% (v/v)로 5 μL의 PCR 제품을 해결하십시오. ~ 330 bps에서 단일 명확한 밴드를 관찰해야한다. 파라마그네틱 비드를 사용하여 PCR 제품을 정화하여 31.5 μL의 (총 부피 0.7배)를 PCR 제품에 재팽창구슬을 추가하고, 잘 혼합하고, RT에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 3분 동안 놓습니다. 구슬은 플레이트의 측면에 캡처해야하며 용액은 명확해야합니다. 조심스럽게 제거하고 상급을 폐기. 튜브에 80% 갓 준비된 에탄올 150 μl을 넣습니다. 30 초 동안 배양 한 다음 조심스럽게 제거하고 상한을 버립니다. 13.6단계를 반복하고, 이번에는 180 μL로 반복한다. 그런 다음 5 분 동안 구슬을 건조시고 있습니다. 자석에서 튜브를 분리합니다. 비드에서 35 μL의 멸균 EB 완충제에 DNA 표적을 용출합니다. 3 분 동안 배양 한 다음 튜브를 자기 랙에 3 분 동안 다시 넣습니다. 용출된 PCR 제품을 함유하는 상급물의 약 30 μL을 깨끗한 튜브로 옮김. 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 샘플을 시퀀싱합니다. HumanV1 gRNA 라이브러리의 경우, 표 4에 나열된 맞춤형 프라이머를 사용하여 19 bp를 시퀀스한다. 11. 수용체 및 관련 경로를 확인하기 위한 생물정보학 분석 MAGeCK의 개수 함수를 사용하여 정렬및 정렬되지 않은 모집단에서 참조 라이브러리로 시퀀스를 매핑합니다. 함수는 원시 개수 파일을 생성합니다(보충표 1).참고 : MAGeCK의 설치 및 MAGeCK 내에서 다른 기능의 사용에 대한 자세한 지침은 왕 등20에의해 이전에 게시 된 프로토콜에 설명되어 있습니다. 화면에 사용된 제어 라이브러리의 기술 표준을 확인합니다. 중간값은 원시 카운트를 정규화하고 R21 또는 동등한 소프트웨어의 ggplot2 패키지를 사용하여 플라스미드에서 카운트의 경험적 누적 밀도 함수 플롯을 플롯하고 정렬되지 않은 샘플을 제어합니다(그림5A). 플라스미드 모집단의 개수를 “제어”로 사용하고 정렬되지 않은 제어 샘플의 개수를 “테스트” 샘플로 사용하여 MAGeCK의 -test 함수를 실행합니다. 이 함수는 유전자 요약 파일을산출한다(보충 표 1). 유전자 요약 파일을 열고 이전에 분류된 필수 및 불필요한 유전자에 대한 로그 폴드변경(neg@lfc column)의 분포를그립니다(그림 5B). 현저하게 고갈된유전자(neg|fdr & 0.05)를 선택하고R(그림 5C)의 농축기23 패키지 또는 이에 상응하는 경로 농축 패키지를 사용하여 경로 농축 분석을 수행합니다. 기본 설정으로 MAGeCK의 -test 함수를 실행합니다. 분류되지 않은 제어 샘플의 원시 개수를”제어”로사용하고 분석을 수행할 때 정렬된 샘플에서”처리”로계산합니다. MAGeCK에서 생성된 유전자 요약 파일을 열고 pos|순위 열의 순위를 오름차순으로 지정합니다. FDR (pos@fdr 열) < 0.05를 적중 식별을 위한 컷오프로 사용합니다. 수용 체는 일반적으로 높은 순위, 종종 첫 번째 위치에. R 또는 이에 상응하는소프트웨어(그림5D)에서양수선택(pos|score)에대한 견고한 순위 알고리즘(RRA) 점수를 플로팅합니다. 유전자 히트를 선택하고 농축 된 경로를 식별하기 위해 R의 농축 기 패키지 또는 동등한 경로 농축 패키지를 사용하여 경로 농축 분석을 수행합니다.