Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.
Estudar múltiplas modificações pós-translacionais (PTMs) de proteínas é um passo crucial para entender o crosstalk PTM e obter insights mais holísticos sobre a função proteica. Apesar da importância dos estudos de enriquecimento multi-PTM, poucos estudos investigam mais de um PTM por vez, devido parcialmente às despesas, tempo e grandes quantidades proteicas necessárias para realizar múltiplas análises proteômicas globais de PTMs. O enriquecimento de afinidade “um pote” detalhado neste protocolo supera essas barreiras ao permitir a identificação simultânea e quantificação de peptídeos com resíduos de lisina contendo acetilação e sucintação ptMs com baixas quantidades de amostra Entrada. O protocolo envolve a preparação de proteínas provenientes de fígados de camundongos de camundongos toquesirt5, desempenho da digestão de trippsina, enriquecimento para PTMs e desempenho da análise espectrométrica em massa utilizando um fluxo de trabalho de aquisição independente de dados (DIA). Como esse fluxo de trabalho permite o enriquecimento de dois PTMs da mesma amostra simultaneamente, fornece uma ferramenta prática para estudar o crosstalk PTM sem exigir grandes quantidades de amostras, e reduz consideravelmente o tempo necessário para a preparação da amostra, dados aquisição e análise. O componente DIA do fluxo de trabalho fornece informações específicas do PTM abrangentes. Isso é particularmente importante ao estudar a localização do site ptm, pois o DIA fornece conjuntos abrangentes de íons fragmentais que podem ser computacionalmente decifrados para diferenciar entre diferentes isoformas de localização do PTM.
Uma miríade de modificações pós-translacionais regulam dinamicamente proteínas e caminhos através de efeitos na atividade1, sinalização2e rotatividade3,4. Por exemplo, as quinases proteicas são ativadas ou desativadas pela adição dos grupos de fosfato5, e a acetilação de histona e outras modificações fornecem um mecanismo para alterar a estrutura da cromatina e servir como mecanismos regulatórios transcricionales6,7. Nos últimos anos, surgiram evidências de que vários PTMs trabalham em conjunto ou competem para regular a função proteica ou atividade8,9,10,11. Portanto, entender o crosstalk ptm é uma necessidade emergente na pesquisa do PTM. No entanto, a maioria dos fluxos de trabalho proteômicos disponíveis para identificar e quantificar os sites de PTM se concentram em modificações únicas, em vez da interação de múltiplas modificações. O fluxo de trabalho descrito correlaciona “pontos quentes” específicos de modificação proteica e resíduos de lisina que são modificados por vários PTMs diferentes.
Há uma necessidade crescente na comunidade científica de métodos viáveis para estudar múltiplos PTMs simultaneamente12. A maioria dos métodos para identificar e quantificar globalmente os locais de vários tipos de PTMs são desafiadores devido aos altos custos e quantidade de tecido necessários12,13. Não só os experimentos de enriquecimento multi-PTM são demorados em termos de preparação de amostras, aquisição de dados e análise de dados, mas esses estudos normalmente requerem grandes e muitas vezes quantidades proibitivas de proteína11. Descrito aqui está um protocolo para enriquecimento e análise simultâneo de vários PTMs, que também aborda várias dessas barreiras e permite o perfil ptm em larga escala e avaliação de crosstalk entre vários PTMs14. Este fluxo de trabalho de um pote descreve uma maneira prática para pesquisadores biomédicos traçarem perfil global de vários PTMs, identificarem peptídeos co-modificados e estudarem o crosstalk PTM de forma eficiente e econômica14,15.
Aqui, este método é mostrado examinando a acylation de proteína mitocondrial, que foi estudada pela primeira vez há mais de 50 anos,16. Concentra-se especificamente na acetilação de lisina17 e na sucinta18,incluindo a co-ocorrência dessas modificações em proteínas e até mesmo a co-modificação no nível peptídeo. Como o estudo utiliza um modelo de rato-de-nocaute sirtuino 5 (SIRT5), ele foi escolhido para se concentrar no enriquecimento de acetilação e locais de sucinta. Esta decisão foi tomada porque os locais de sucinta são alvos da SIRT5 dessuccinylase e, portanto, espera-se que mostrem uma significativa upregulação em camundongos KO, tornando-os os PTMs mais relevantes neste caso. Ambos os PTMs são biologicamente relevantes como recentemente resumido por Carrico et al.19. Em geral, a acetilação mostra efeitos importantes na expressão genética e no metabolismo, e a sucinta tem sido relatada para regular o metabolismo cardíaco e a função20.
O protocolo descrito pode ser realizado com baixa quantidade de material de insumo proteico (por exemplo, 1 mg de proteína) e reduz a duração total do experimento reduzindo o tempo gasto para processamento de amostras, aquisição de MS e análise de dados. Um esquema de fluxo de trabalho é fornecido na Figura 1. Também usamos quantidades ainda menores de material inicial (até 100 μg de isato de proteína, reduzindo as quantidades de contas utilizadas em conformidade), o que, como esperado, reduz o rendimento global dos peptídeos acylated identificados; no entanto, ele ainda fornece resultados altamente valiosos e peptídeos acírquios quantificáveis.
Embora os chamados fluxos de trabalho de cima para baixo ou médio-down normalmente não utilizem abordagens de digestão proteolítica (e assim mantenham a conectividade de vários PTMs dentro de uma proteína), este protocolo se concentra em uma abordagem de enriquecimento de afinidade baseada em peptídeo para obter profundidade extra e sensibilidade para identificação e quantificação ptm(Figura 1). Além disso, esse fluxo de trabalho centrado no peptídeo utiliza métodos modernos de espectrometria de massa, incluindo 1) uma combinação de aquisição dependente de dados (DDA) para gerar bibliotecas espectrais e 2) aquisição independente de dados (DIA) para quantificação ptm precisa em um fluxo de trabalho sem rótulos.
Os fluxos de trabalho do DIA superam a amostragem de esquemas típicos de varredura dda, fragmentando abrangentemente todos os sinais de peptídeo dentro da faixa m/zamostrada 21. Esse recurso também é extremamente benéfico em termos de localização do site, pois é mais fácil obter informações sobre quais íons específicos de fragmentos são modificados dentro do peptídeo. Além disso, os fluxos de trabalho dia permitem a identificação e quantificação de pequenas isoformas ptm-peptídeos com íons precursores idênticos. Os métodos DIA também podem determinar uma localização específica do site PTM dentro de um peptídeo com base em íons específicos correspondentes que são amplamente medidos em todos os momentos. No entanto, as abordagens dda muitas vezes utilizam características de “exclusão dinâmica” que excluem múltiplas amostragem de MS/MS para o mesmo íon precursor, perdendo assim pequenas isoformas PTM.
A estratégia simultânea de enriquecimento aqui descrita é idealpara estudos que se beneficiarão do perfil global e quantificação de vários PTMs, examinando o crosstalk ptm e entendendo as interações dinâmicas das modificações pós-translacionais. A identificação de múltiplos PTMs enriquecidos em um fluxo de trabalho combinado foi descrita por: enriquecimento global, serial ou paralelo do PTM contendo peptídeos proteolíticos, ou, alternativamente, pela análise de proteínas intactas. Em comparação direta com o enriquecimento serial da acetilação e sucintação, a eficiência da metodologia de um pote foi estabelecida como sendo muito semelhantea 14. Esses protocolos alternativos exigem quantidades significativas de material e tempo iniciais e podem ser proibitivamente caros. Em contrapartida, o protocolo de um pote fornece um método barato e eficiente para enriquecimento de mais de um PTM com análise e identificação subsequentes.
Os tecidos hepáticos do rato são obtidos de ratos sirt5 e são usados aqui como material inicial. Este protocolo também pode ser realizado para lisates proteicos de diferentes tecidos ou experimentos de cultura celular. Este protocolo pode ser aplicado a lisates proteicos obtidos a partir de tecidos ou pelotas de cultura celular.
Este protocolo descreve uma nova técnica para o enriquecimento simultâneo de múltiplos PTM para entender mais efetivamente o crosstalk ptm. Métodos alternativos de atingir esse objetivo tendem a ser proibitivamente demorados e caros, e exigem grandes quantidades de proteína para serem bem sucedidos11,13. Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho de enriquecimento multi-PTM que envolve incubação em contas conjugadas por anticorpos para dois PTMs ao mesmo tempo para melhorar a eficiência geral do experimento. Este método também envolve o uso de DDA para geração de bibliotecas espectrais e aquisições dia MS para detectar e quantificar os peptídeos presentes com interferência reduzida de íons fragmentados22,23. Programas de software, como os mecanismos de pesquisa de banco de dados ms são usados para analisar e quantificar dados de aquisições de DDA, enquanto o Quantitative Proteomics Software24 e o software específico de análise quantitativa DIA25 são necessários para interpretar o espectro complexo produzido pelas aquisições da DIA.
Existem vários passos críticos dentro deste protocolo que devem ser seguidos cuidadosamente. Como o principal objetivo do protocolo é enriquecer para vários PTMs simultaneamente, a etapa de enriquecimento anticorpo-afinidade (seção 2) é fundamental para o sucesso do experimento. Ao realizar lava-jatos nas contas, é necessário garantir que nenhuma das contas seja aspirada acidentalmente. Garantir que a concentração de ureia tenha sido diluída para 1 M antes da digestão com a trippsina (passo 1.8) também é necessária. Embora a ureia de 8 M seja exigida no protocolo de solubilização proteica, as concentrações de ureia acima de 1 M inibirão a atividade enzimática da trippsina. Além disso, é importante verificar consistentemente o pH da amostra em todo o protocolo. Isso é especialmente importante antes da digestão. Se o pH da amostra e a solução de trippsina não forem neutralizados adequadamente antes da incubação, pode resultar em uma digestão ineficiente em que muitos locais de decote podem ser perdidos, resultando em menos identificações de peptídeos.
Algumas modificações no protocolo podem ser úteis ao preparar amostras. Para um lysate de proteína adquirido a partir de 1 mg de material inicial, um quarto das contas de anticorpos fornecidas em cada tubo de varredura PTM pode ser usada como uma alternativa econômica. Uma maior quantidade de material inicial pode ser usada para melhores resultados, desde que a quantidade de contas de anticorpos utilizadas seja aumentada proporcionalmente. Outra modificação que pode melhorar o fluxo de trabalho é digerir amostras com outro protease, além da trippsina. Essa modificação resultaria em mais variabilidade nos peptídeos, proporcionando maior cobertura de resíduos proteicos. Embora não seja necessário, recomenda-se que a metese seja uma das enzimas utilizadas para análise de PTM devido à sua alta especificidade do decote26.
Uma limitação desse protocolo é que os PTMs que estão sendo estudados precisam ter químicas semelhantes para serem enriquecidos simultaneamente14. Os procedimentos para as diferentes contas conjugadas por anticorpos devem ser semelhantes, utilizando solventes e soluções semelhantes, incluindo condições de elusão semelhantes e, preferencialmente, do mesmo fornecedor. Por essa razão, o método aqui descrito usa consistentemente acetilação e sucinta como exemplo, ambos usam contas conjugadas com anticorpos (Cell Signaling Technology, Inc). Embora esse método possa teoricamente ser aplicado a qualquer número de PTMs, seriam necessários estudos adicionais para avaliar a limitação exata do protocolo nesse sentido. Além disso, como se trata de um método de enriquecimento baseado em anticorpos, o método só pode fornecer uma quantificação relativa dos sites de PTM.
Em comparação com os métodos de enriquecimento multi-PTM existentes, esse fluxo de trabalho é uma alternativa mais viável e econômica. A partir deste experimento, observou-se que a eficácia deste método se compara extremamente bem com métodos alternativos, como enriquecimentos individuais ou seriais. A Figura 2B mostra que o CV mediano das áreas de pico de peptídeos modificados foi realmente diminuído no método de um pote em comparação com enriquecimentos de PTM único e enriquecimentos de PTM em série13. Analisamos ainda os resultados experimentais avaliando as quantificações do nível do local para acetilação ou sucinta. Além disso, a análise de correlação de Spearman (Figura 2C,D) demonstrou que o enriquecimento ptm de um pote teve desempenho semelhante aos fluxos de trabalho de enriquecimento de um único PTM. Isso também era verdade para as correlações de peptídeo e fragmentação. A mesma observação foi realizada para as três correlações ao comparar um pote com enriquecimento serial-PTM.
Esse protocolo permite que os pesquisadores façam insights biológicos fascinantes sobre o crosstalk PTM de forma rápida e econômica. O componente DIA do fluxo de trabalho permite que os pesquisadores entendam mais sobre os PTMs, pois fornece informações sobre localização do local e supera desafios como baixa ocupação de PTMs. Os íons precursores tendem a ser excluídos com DDA, o que é particularmente importante ao estudar PTMs, pois a ocupação do local muitas vezes é baixa ao ponto em que esses peptídeos não são selecionados para MS/MS, mas ainda contêm informações cruciais. Experimentos de acompanhamento poderiam ser realizados para avaliar o limite superior de quantos PTMs podem ser enriquecidos simultaneamente usando este método. Uma melhoria futura desse fluxo de trabalho pode incluir o desenvolvimento de plataformas de software mais avançadas para automatizar ainda mais a análise da localização do site e a ocupação do site ptm.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos o apoio da concessão de instrumentação compartilhada do NIH para o sistema TripleTOF no Buck Institute (1S10 OD016281). Este trabalho também contou com o apoio do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (R01 AI108255 a B.S.) e do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (R24 DK085610 a Eric Verdin; R01 DK090242 para Eric Goetzman). X.X. foi apoiado por uma bolsa dos Institutos Nacionais de Saúde (concessão do NIH T32GM8806, para Judith Campisi e Lisa Ellerby), N.B. foi apoiada por uma bolsa de pós-doutorado da Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |