Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

1. Síntese de Alkyne-fluoroforres Síntese de NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine) Dissolva 1.031 mg de 4-chloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) em 60 mL de tetrahidrofurano (THF). Adicione 1.857 mg de CsCO3 (5.696 mmol), depois 0,39 mL de propargylamina (6,1 mmol). Aqueça a reação a 50 °C por 2 h, que passará de marrom para verde, depois esfrie para temperatura ambiente (RT). Filtre a reação usando um aparelho de filtragem (ver Tabela de Materiais)e lave com acetato etílico (EA). Concentre o filtramento pressão reduzida, depois dissolva o resíduo em 150 mL de EA e passe para um funil de separação de 500 mL. Lave a solução EA com 100 mL com água e salmoura, respectivamente. Em seguida, misture as fases aquosas e lave 2x com 100 mL de EA. Seque as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de magnésio anidro, depois filtre e concentre-se pressão reduzida. Purificar o produto bruto por cromatografia flash em gel de sílica (20-30% EA em éter de petróleo [PE]), verificando a pureza por espectrometria de massa de cromatografia líquida (LCMS, [M+H]+ = 219,1) e/ou ressonância magnética nuclear (NMR), mudanças químicas da seguinte forma:1 H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13 C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76,5, 74.2, 33,4.NOTA: Ao realizar a purificação pela cromatografia do gel de sílica, prepare a coluna usando o menos polar dos solventes listados. O composto bruto pode ser carregado como uma solução concentrada ou adsorlado na sílica se a solubilidade não permitir. Depois que o composto foi adicionado ao topo da sílica, passe por volumes de coluna de 1-2 do mesmo solvente usado para muslica molhada. Em seguida, comece com a relação solvente listada, passando pelo volume de pelo menos 1 coluna de cada solvente, e certificando-se de não fazer grandes saltos na composição de solventes. Colete frações e verifique a pureza/identidade por LCMS ou TLC (cromatografia de camada fina). Combine frações puras e concentre-se pressão reduzida por evaporação rotativa. Síntese de DMACA-alkyne (2-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).Dissolva 5,02 g de 3-(dimetilamino)fenol (36,6 mmol) em 30 mL de etanol, em seguida, adicione 6,7 mL de diethyl 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Adicione 10,5 g de ZnCl2 (77,2 mmol), depois refluxo a solução vermelha por 42 h. Adicione mais 9,20 g de ZnCl2 (67,6 mmol), em seguida, refluxo para 8 h. Esfrie a reação e concentre-se pressão reduzida. Disperse o sólido vermelho resultante em 200 mL de EA, filtro, em seguida, transfira para um funil de separação de 500 mL. Lave o EA com 200 mL cada água e salmoura, depois seque sobre sulfato de magnésio de anidro. Filtre a fase orgânica seca e concentre-se pressão reduzida. Purificar o sólido vermelho (etiletilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)acetato) por cromatografia flash em gel de sílica (0-100% EA em PE), verificando a pureza por LCMS ([M+H]+ = 275,1) e/ou NMR, mudanças químicas da seguinte forma:1 H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H). Dissolver 488 mg de etilo 2-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetato (1,18 mmol) em 10 mL de THF, em seguida, adicionar uma solução de 157 mg de LiOH· H2O (3,74 mmol) em 15 mL de água. Mexa a reação na RT por 3 h, depois mova-se para um funil separado e dilua com mais 50 mL de água. Lave a mistura de reação 2x com 50 mL de eter diethyl (Et2O), em seguida, lave a fase orgânica combinada 2x com 25 mL de água. Tome qualquer precipitação amarela com a camada orgânica. Concentre a fase orgânica pressão reduzida usando um evaporador rotativo. Acidifique a fase aquosa para pH = 2 com HCl concentrado, e esfrie até 4 °C durante a noite. Filtre a fase aquosa acidificada e adicione o sólido amarelo à fase orgânica concentrada.NOTA: O ácido acético 2-(7-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)ácido acético pode ser usado sem maior purificação, mas isso pode ser verificado por LCMS ([M+H]+ = 247,1) e/ou NMR, mudanças químicas da seguinte forma:1 H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13 C NMR (CDCl3,150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98,3, 40.2, 18,5. Dissolva 466 mg de ácido acético de 2-(7-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)ácido acético (1,89 mmol) em 7 mL de Nseco,N-dimetilformamida (DMF) e coloque uma atmosfera de nitrogênio. Dissolver 0,33 mL de propargylamina (5,1 mmol) em 7 mL de DMF seco nitrogênio. Adicione 1,30 mL de amina di-isopropilethyl (DIPEA, 7,50 mmol) à solução de tintura, depois 535 mgde O-(1H-6-clororobenzotriazol-1-yl)-1,1,3-tetrametiluronium hexafluorophophophofato (HCTU, 1,29 mmolmol). Mexa a solução de tinta ativada por 15 min na RT, depois adicione a solução de amina em sentido e deixe se mexer durante a noite. No dia seguinte, diluir a reação com 35 mL de água e concentrar-se pressão reduzida. Particione o sólido laranja resultante entre EA e salmoura (100 mL cada) em um funil de separação de 250 mL. Separe as camadas (execute as duas camadas em diferentes frascos) e lave a fase aquosa com 100 mL de EA. Concentre as fases orgânicas combinadas pressão reduzida e, em seguida, redissolva o sólido laranja em 3 mL de 1:1 aceonitrila (ACN)/água (v/v). Purificar o produto bruto injetando em um sistema de cromatografia líquida de média pressão (MPLC) de fase inversa equipado com uma coluna de cartuchoC18 (solvente A: água, solvente B: ACN). Verifique as frações de pureza por LCMS ([M+H]+ = 284,1, alterações químicas nmr dadas abaixo), em seguida, combinar e lyofamizar frações apropriadas para dar 2-(7-(dimetilamino)-2-oxo-2H-cromado-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, nmr mudanças químicas como segue:1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.65 (t, J = 5,4Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3.88-3.87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3.01 (s, 6H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97,5, 80.9, 73,3, 39,7, 38.4, 28,2. 2. Síntese de Antibióticos Fluorescentes Prepare um azide-derivado de um antibiótico como descrito anteriormente14,15,16.NOTA: O procedimento é específico para cada antibiótico e requer um exame cuidadoso da relação de atividade da estrutura (SAR) da molécula-mãe para garantir que o antibiótico funcional mantenha a atividade comparável ao pai. (por exemplo, ciprofloxacina16, linezolid14, e trimethoprim15). Veja a Figura 1 como exemplos de antibióticos fluorescentes publicados e o esquema geral de síntese. Clique no procedimento de reação ANOTA: Para a maioria dos antibióticos, siga o procedimento detalhado aqui para huisgen catalisado de cobre [2+3] cicloaddition de azide (passo 2.1) e alquine fluorescente (preparado na etapa 1). Coloque o antibiótico azide em um frasco inferior redondo e adicione tert-butanol(tBuOH) e água (1:1 v/v, 25 mL cada por azide mmol). Adicione o fluoroforre-alquina preparado na etapa 1.1 (3 eq.) e aqueça a reação a 50 °C. Em seguida, adicione sulfato de cobre (100 mM na água, 0,6 eq.) à reação, seguido de ácido ascórbico (500 mM na água, 2,4 eq.). Mexa a reação a 50 °C por 1 h, ou até análise por LCMS mediante indicação da conclusão da reação (consumo completo de azide inicial). Esfrie a reação e purificar conforme apropriado para o andaime antibiótico e proceda para purificação pela etapa 2.3 ou 2.4.NOTA: Vários métodos diferentes de purificação são possíveis, dependendo da polaridade e estabilidade do andaime. Clique no procedimento de reação BNOTA: Siga este procedimento para antibióticos à base de peptídeos, para fornecer condições de reação mais fortes (trabalho inédito, Phetsang, 2019). Coloque o peptídeo azida-antibiótico em um frasco inferior redondo e adicione DMF suficiente (750 mL/mmol azide) para dissolver. Adicione o fluorofófo-alquina preparado na etapa 1 (5 eq.) e aqueça a reação a 50 °C por 1 h. Adicione cobre (I) iodeto (20 q.), depois DIPEA (120 q.), depois ácido acético (240 q.). Mexa a reação a 50 °C por 1 h, ou até que a análise por LCMS indique conclusão de reação (ou seja, consumo completo de azide inicial). Esfrie a reação e prossiga para purificação pelo método 1 (ver passo 2.3). Método de purificação 1 (usado para ciprofloxacina, trimetoprim e linezolid) Injete a reação do clique resfriado diretamente em uma coluna de cartuchos MPLC C18. Incorpore uma longa fase de lavagem (cerca de 10 min) no início da corrida (100% solvente A), em seguida, execute um gradiente até 100% solvente B, seguido de um retorno ao solvente A.NOTA: Solvente A pode ser escolhido a partir de água, 0,05-0,1% ácido fórmico (FA) na água, 0,05-0,1% ácido trifluorocético (TFA) na água, dependendo da solubilidade, estabilidade e da melhor resolução dos picos. Solvente B pode ser escolhido entre acetonitrila (ACN), 0,05-0,1% FA na ACN, 0,05-0,1% TFA na ACN, para igualar solvente A. Se a elusão se mostrar difícil, o metanol pode ser usado no lugar da ACN. Coletar e combinar frações apropriadas, como indicado pela LCMS e cor (massa correta vista, pico singular), então liofilize para dar o (semi)puro antibiótico fluorescente. Purificar ainda mais o produto, se necessário. Avalie a pureza por NMR e/ou LCMS e a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), utilizando uma coluna e método apropriados para o andaime. Método de purificação 2NOTA: Se a solubilidade permitir, a preepurificação pode ser realizada pelo trabalho aquoso (usado para macrolides, trabalho inédito, Pedra 2019). Diluir a reação de clique resfriado com água e Et2O (1:1 v/v, aproximadamente 10 vezes diluição do volume inicial de reação), transferindo-se para um funil separador de tamanho apropriado. Separe as camadas e lave a fase aquosa duas vezes com Et2O. Lave as fases orgânicas combinadas 2x com água (volume igual com fase orgânica), depois seque sobre Na2SO4. Filtre a fase orgânica seca e concentre-se pressão reduzida. Purificar o produto bruto pela MPLC e/ou HPLC descrito na etapa 2.4.4.NOTA: Veja a Figura 2 como exemplos de traços LCMS de reação de clique incompletos, completos e purificados. Os rendimentos purificados típicos para as reações de clique antibiótico-fluoroforre variam de 30 a 80%.ATENÇÃO: A maioria dos produtos químicos usados nessas sintes possuem riscos específicos de segurança. A cautela deve ser tomada o tempo todo, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual. Et2O, tBuOH, FA, ácido acético, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamina e HCTU são todos inflamáveis; evitar contato com fontes de calor ou faísca. THF, propargylamina, DIPEA, tBuOH, FA, DMF e PE são todos tóxicos; evitar exposição. Propargylamina, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, ácido acético e HCl são todos corrosivos; evitar contato e estar atento ao contato superficial. ZnCl2, CuSO4,CuI e PE apresentam riscos ambientais; estar atento às condições de descarte. ThF pode formar peróxidos explosivos; tome cuidado com as condições de armazenamento. Azidas orgânicas são explosivas; tomar cuidado especialmente com a produção em larga escala. 3. Avaliação da Atividade Antimicrobiana NOTA: Todo o trabalho envolvendo bactérias deve ser realizado em condições estéreis para evitar a contaminação do ensaio ou do laboratório. Todos os meios de comunicação devem ser autolavados antes do uso, e o plástico e equipamentos como pipetas devem ser mantidos estéreis. Recomenda-se que o trabalho seja feito em um capô de biocontenção (tipo 2). Os estoques de glicerol de raia de cepas bacterianas apropriadas para o andaime antibiótico no ágar de caldo lisogeniano (LB, preparado pelas instruções do fabricante) e crescem durante a noite a 37 °C.NOTA: A escolha das bactérias para testar a atividade antibacteriana deve ser feita com base no andaime antibiótico que está sendo usado. Uma faixa representativa de 5 a 10 bactérias deve ser escolhida a partir da espécie que é conhecida por ser suscetível ao antibiótico, considerando-se as capacidades logísticas do laboratório. Se possível, bactérias resistentes também devem ser testadas. O protocolo dado abaixo funcionará na maioria das bactérias, mas verifique se são necessárias condições especiais (por exemplo, CO2,mídia especial) e faça alterações conforme necessário. As bactérias com sucesso que usam essas condições incluem Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecium. Escolha uma única colônia da placa, e cultura durante a noite em 5 mL de caldo Mueller-Hinton ajustado (CAMHB, preparado pelas instruções do fabricante) a 37 °C. Diluir as culturas durante a noite ~40 vezes em CAMHB e crescer até uma fase média de log, densidade óptica a 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volume 5 mL). Prepare as soluções de estoque de cada antibiótico fluorescente a 1,28 mg/mL em água estéril, e pipette 10 μL de antibiótico para a primeira coluna de uma placa de poço de 96. Adicione 90 μL de CAMHB à primeira coluna e 50 μL a todos os outros poços. Em seguida, realize diluição serial de duas vezes através da placa. Misture completamente, em seguida, diluir as culturas de fase de tronco médio para ~106 unidades de formação de colônia (CFU)/mL e adicionar 50 μL a todos os poços, para fornecer uma concentração final de ~5 x 105 CFU/mL.volume de cultura (mL) = (volume de mídia em mL)/(OD600 x 1.000)por exemplo, para uma cultura OD600 = 0,5 em um volume de mídia desejado de 12 mL, adicione (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL de cultura para 12 mL de mídia Cubra as placas com tampas e incuba a 37 °C por 18-24 h sem tremer. Inspecione visualmente as placas, com o MIC sendo a menor concentração bem sem crescimento visível.NOTA: Consulte a Tabela 1 para alguns exemplos de antibióticos fluorescentes ativos e inativos. 4. Análise do Acúmulo de Sondas por Espectrofotometria e Citometria de Fluxo NOTA: Esses tempos de centrífuga foram otimizados para E. coli,de modo que pequenas alterações podem ser necessárias para outras espécies. Dados representativos para acúmulo de sondas são relatados para a sonda ciprofloxacina com rótulo NBD. Os estoques de glicerol de raia das cepas bacterianas em ágar LB e crescem durante a noite a 37 °C. Escolha uma única colônia da placa e cultura durante a noite em LB a 37 °C. Diluir culturas durante a noite ~50 vezes na mídia e crescer até a fase média do log (OD600 = 0,4-0,8). Centrífuga simem as culturas a 1.470 x g por 25 min e decantam a mídia. Resuspender as bactérias em 1 mL de soro soro alvejado de fosfato (PBS), depois centrífuga sacada a 1.470 x g por 15 min. Decante a mídia e resuspenda as pelotas lavadas na PBS para um OD600 = 2 final. Se desejar, adicione 10,1 μL de cianeto carbonil 3-clorofenihididágua (CCCP, 10 mM em PBS) a 1 mL de bactérias (concentração final de 100 μM) e incubar a 37 °C por 10 min.NOTA: CCCP é um inibidor da bomba efflux. A adição da CCCP permitirá o exame do impacto da efflux. Centrífuga sicule as culturas a 18.000 x g por 4 min a 20 °C e decante a mídia. Adicione 1 mL de solução de antibiótico fluorescente (10-100 μM em PBS) à pelota, e incuba a 37 °C por 30 min. Centrífuga sicule as culturas a 18.000 x g por 7 min a 4 °C e decante a mídia. Resuspender as bactérias em 1 mL de PBS frio, e repita a etapa 4.9. Repita o passo 4.10 um total de 4x. Se desejar, as bactérias lise adicionando 180 μL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 2 mM edta de sódio) em seguida 70 μL de lysozyme (72 mg/mL em H2O). Incuba-se a 37°C por 30 min, depois congele-degelo 3x (-78 °C para 5 min, depois 34 °C para 15 min). Sone as amostras por 20 min, depois aqueça até 65 °C por 30 min. Centrífuga sed amostras (18.000 x g, 8 min), em seguida, filtrar através de uma membrana de filtro de 10 kDa. Lave o filtro o 4x com 100 μL de água. Transfira o lysato para uma placa preta de fundo plano 96 e meça a intensidade da fluorescência em um leitor de placa com comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para o fluoroforre (ou seja, DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).NOTA: Veja a Figura 3 como exemplos de análises espectrofotométricas de bactérias usando o antibiótico de ciprofloxacina com rótulo NBD fluorescente. Para análise por citometria de fluxo, podem ser utilizadas as mesmas condições de crescimento e coloração (etapas 4.1-4,17), com mudanças exclusivamente na preparação final. Leve o volume total para 1 mL de PBS. Leia amostras em um címetro de fluxo a uma taxa de fluxo de aproximadamente 60 μL/min, utilizando amplificação logarítmica para aquisição de dados (excitação de F1 = 488 nm; emissão = 525/20 nm). Registre um total de 10.000 eventos e, em seguida, analise os dados usando software apropriado. Traçar a intensidade da fluorescência da F1 contra o número de ocorrências, estimando a intensidade mediana da fluorescência dos picos de histograma depois que a bactéria foi manchada.NOTA: Veja a Figura 4 como exemplos de análises de citometria de fluxo de bactérias usando o antibiótico ciprofloxacina com rótulo NBD. 5. Preparação para Análise Microscópica Cresça subculturas para OD600 = 0,4, quanto à avaliação do MIC, depois divida em 1 mL alíquotas e centrífugas em 18.000 x g por 3-5 min. Decante e descarte mídia, em seguida, resuspender a pelota bacteriana em 500 μL de HBSS. Centrífuga a 18.000 x g por 3 min, depois decanta e descarta mídia. Prepare soluções de sondas de antibióticos no HBSS em concentrações de 1 a 100 μM. Resuspender as bactérias lavadas em 500 μL da solução da sonda, e incuba a 37 °C por 30 min. Repita o passo 5.3. Para um experimento de rotulagem múltipla, resuspenda a pelota em 500 μL de um corante ácido nucleiano de cor ortogonal. Para verde, use Syto9 (5 μM em HBSS); para azul, use Hoechst 33342 (20 μg/mL no HBSS). Incubar na RT por 15-30 min. Repita a etapa 5.3, depois resuspenda em 500 μL de FM4-64FX (5 μg/mL no HBSS) e incuba r$ 5 min. Repita a etapa 5.3, depois resuspenda em 500 μL de HBSS e repita a etapa 5.3 mais uma vez. Repita a etapa 5.8, depois suspenda as bactérias lavadas e dyed em 15 μL de meio de montagem (ver Tabela de Materiais). Pipette montando meio em um slide de microscópio e cubra com um deslizamento de tampa de alto desempenho, em seguida, selar bordas com esmalte claro.NOTA: Veja a Figura 5 como exemplos de imagens de microscopia confocal tiradas com antibióticos de ciprofloxacina e trimetoprim com rótulo de NBD, e figura 6 para antibiótico de oxazolidinona com rótulo DMACA (linezolid).