형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

1. 알키네 형광단합성 NBD-알킨합성 (7-니트로-N-(prop-2-yn-1-yl)벤조[c][1,2,5]옥사디아졸-4-아민) 테트라하이드로푸란(THF)의 60 mL에 4-클로로-7-니트로-벤조푸란(5.181 mmol)의 1,031 mg을 용해시. 추가 1,857 CsCO의 mg3 (5.696 mmol), 다음 프로 파 질 라 민의 0.39 mL (6.1 mmol). 반응을 갈색에서 녹색으로 변한 다음 실온(RT)으로 냉각하는 2시간 동안 50°C로 가열합니다. 여과 보조제(재료 표참조)를 사용하여 반응을 필터링하고 에틸 아세테이트(EA)로 세척합니다. 감압하에 여과액을 농축한 다음, EA 150 mL에서 잔류물을 용해시키고 500 mL 분리 깔때기로 이동합니다. EA 용액을 물과 염수로 각각 100 mL로 씻으소서. 그런 다음 수성 단계를 결합하고 EA의 100 mL로 2x를 세척하십시오. 무수 마그네슘 황산마그네슘 위에 결합된 유기상을 건조한 다음, 저압하에서 필터와 농축을 하십시오. 실리카 겔(석유 에테르의 20-30% EA)에 플래시 크로마토그래피에 의한 조료 를 정화하고, 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LCMS, [M+H]+ = 219.1) 및/또는 핵 자기 공명(NMR) 분광법, 화학적 변화에 의한 순도를 확인한다.1개 H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.7 Hz, J = 2.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 2.5 Hz, 1H); 13세 C NMR(CD3OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.참고: 실리카 겔 크로마토그래피에 의한 정제를 수행할 때, 열거된 용매의 극성 이하를 사용하여 컬럼을 준비한다. 조화합물은 용해도가 허용되지 않는 경우 농축용액으로서 적재되거나 실리카 상에 흡착될 수 있다. 화합물이 실리카의 상부에 첨가된 후, 실리카 습윤에 사용되는 동일한 용매의 1-2 컬럼 부피를 통해 실행한다. 그런 다음 나열된 용매 비율로 시작하여 각 용매의 적어도 1 개의 컬럼 부피를 통해 실행하고 용매 조성에서 큰 점프를하지 않도록하십시오. 분획을 수집하고 LCMS 또는 TLC (얇은 층 크로마토그래피)에 의해 순도 / 신원을 확인합니다. 순수한 분획을 결합하고 회전 증발에 의해 감소 된 압력하에서 농축. DMACA 알키네의 합성 (2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크롬-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)아세타미드).에탄올 30 mL에 3-(디메틸아미노) 페놀(36.6 mmol)의 5.02 g을 용해한 다음, 6.7 mL의 디에틸 1,3-아세톤디카르박실레이트(36 mmol)를 첨가합니다. ZnCl2 (77.2 mmol)의 10.5 g을 추가한 다음 42 시간 동안 빨간색 용액을 환류한 다음 ZnCl2 (67.6 mmol)의 9.20 g을 추가한 다음 8 시간 동안 역류합니다. 반응을 식히고 감소된 압력하에서 농축하십시오. 결과적 적색 고체를 EA 200 mL에서 분산시킨 다음 필터를 500 mL 분리 깔때기로 옮김을 전달합니다. EA를 각각 200 mL의 물과 염수로 씻은 다음 무수 마그네슘 황산염으로 건조시면 됩니다. 건조 된 유기 상을 필터링 하 고 감소 된 압력에서 농축. 실리카 겔(PE에서 0-100% EA)에 플래시 크로마토그래피에 의해적색 고체(에틸 2-(7–7–2-oxo-2-크롬-4-yl)아세테이트를 정화하고, LCMS([M+H]+++275.1) 및/또는 NMR에 의한 순도 를 검사한다.1개 H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.30 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 8.9 Hz, J = 2.6 Hz, 1H), 6.40 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.87 (m, 1H), 2.96 (m, 8H), 2.25 (d, J = 1.2 Hz, 3H). THF 10 mL에 에틸 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2 H-크롬-4-yl)아세테이트(1.18 mmol)를 용해한 다음, 157 mg의 LiOH· H2O (3.74 mmol) 물 15 mL. RT에서 반응을 3 시간 동안 저어시킨 다음 분리 된 깔때기로 이동하여 추가로 50 mL의 물로 희석하십시오. 반응 혼합물을 50 mL의 디에틸 에테르(Et2O)로 2x 세척한 다음, 25 mL의 물로 결합된 유기상 2x를 세척한다. 유기 층으로 노란색 침전을 가져 가라. 회전 식 증발기로 감소 된 압력하에서 유기 상을 농축하십시오. 수성상을 pH=2로 농축된 HCl로 산성화하고, 밤새 4°C로 냉각한다. 산성화된 수성 상을 걸류하고 농축된 유기상에 황색 고체를 첨가한다.참고 : 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크롬-4-yl)아세트산은 추가 정제없이 사용할 수 있지만 LCMS ([M +H]+ = 247.1) 및 / 또는 NMR, 다음과 같이 화학 적 변화에 의해 확인할 수 있습니다:1개 H NMR (CDCl3,600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 9.2 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H), 2.35 (d, J = 0.9 Hz, 2H); 13세 C NMR (CDCl3,150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5. 466 mg의 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2 H-크롬-4-yl)아세트산(1.89 mmol)을 7 mL의 드라이 N,N-디메틸포마미드(DMF)에용해시키고 질소의 대기하에 놓습니다. 질소 하에서 건조 DMF의 7 mL에 프로 파 질 라 민 (5.1 mmol)의 0.33 mL를 용해. 1.30 mL의 디이소프로플레텔레틸 아민 (DIPEA, 7.50 mmol)을 염료 용액에 넣고 535mg의 O -(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-yl)-1,1,1,3,3,3테트라메틸루로늄 헥사플루오로포스페이트(HTUmol, 29mmol)를 첨가한다. RT에서 활성화된 염료 용액을 15분 간 저은 다음 아민 용액을 한 방울 떨어뜨리고 밤새 저어줍니다. 다음 날, 35 mL의 물로 반응을 희석 한 다음 감소 된 압력하에 농축하십시오. 생성된 주황색 고체를 EA와 염수(각각 100mL)를 250mL 분리 깔때기에서 분할합니다. 레이어를 분리하고(두 레이어를 다른 플라스크로 실행) EA 의 100 mL로 수성 단계를 세척합니다. 결합된 유기상을 저압하에 농축한 다음, 오렌지 고체를 1:1 아세토니트릴(ACN)/물(v/v)의 3mL로 다시 용해시고. C18 카트리지 컬럼(용매 A: 물, 용매 B: ACN)이 장착된 역상 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 시스템에 주입하여 원유 제품을 정화합니다. LCMS에 의한 순도 검사([M+H]+ = 284.1, 아래 주어진 NMR 화학 적 변화), 다음 결합 및 2-(7-(디메틸아미노)-2-옥소-2H-크롬-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)아세타미드, NMR 화학 적 시프트다음과 같이 적절한 분획을 주고 적절한 분획을 결합하고 동호우성 화1개 H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ 8.65 (t, J = 5.4Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.88-3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1H, 0H, 0H) 13세 C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 28. 2. 형광 항생제의 합성 앞서14,15,16에기재된 바와 같이 항생제의 아지드 유도체를 준비한다.참고: 절차는 각 항생제에 특정하고 기능화된 항생제가 부모에 필적하는 활성을 유지하는지 확인하기 위하여 부모 분자의 구조 활성 관계 (SAR)의 주의 깊은 검토가 요구됩니다. (예를 들어, 시프로플렉스사신16,라인졸리드14,및 트리메쇼프림15). 도 1은 발표된 형광 항생제 및 일반 합성 계획의 예에 대한 예. 반응 프로시저 A를 클릭합니다.참고 : 항생제의 대부분을 들어, 구리 촉매 Huisgen [2 + 3] 아지드 (단계 2.1) 및 형광 알키네 (1 단계에서 제조)의 사이클로 추가에 대해 여기에 상세한 절차를 따르십시오. 둥근 바닥 플라스크에 아지드 항생제를 넣고 테르트-butanol(tBuOH) 및 물 (1 : 1 v / v, 25 ml 각 mmol azide 당)을 추가합니다. 1.1단계(3 eq.)에서 제조된 형광알키네를 첨가하고 반응을 50°C로 가열한다. 그런 다음 반응에 구리 황산염 (물 100 mM, 0.6 eq.)을 넣고 아스코르브 산 (물 500 mM, 2.4 eq.)을 추가합니다. 50°C에서 1시간 동안 또는 반응 완료(시작 아지드의 완전한 소비)의 표시시 LCMS에 의해 분석될 때까지 반응을 교반한다. 항생제 스캐폴드에 적합한 반응을 냉각시키고 2.3 단계 또는 2.4단계로 정화를 진행한다.참고 : 스캐폴드의 극성과 안정성에 따라 여러 가지 정제 방법이 가능합니다. 반응 절차 B를 클릭합니다.참고 : 펩티드 기반 항생제에 대한이 절차를 따라 더 강한 반응 조건을 제공합니다 (출판되지 않은 작업, Phetsang, 2019). 펩타이드 아지드 항생제를 둥근 바닥 플라스크에 넣고 충분한 DMF (750 mL / mmol azide)를 첨가하여 용해시도록 하십시오. 1단계(5 eq.)에서 제조된 형광-알퀴네를 첨가하고 반응을 1시간 동안 50°C로 가열한다. 구리 (I) 요오드화물 (20 eq.), DIPEA (120 eq.), 다음 아세트산 (240 eq.)을 추가합니다. 1 시간 동안 50 °C에서 반응을 교반하거나 LCMS에 의한 분석이 반응 완료를 나타냅니다 (즉, 시작 아지드의 완전한 소비). 반응을 냉각시키고 방법 1에 의한 정제를 진행한다(단계 2.3 참조). 정화 방법 1 (시프로플렉스사신, 트리메토프림 및 라인졸리드에 사용) 냉각된 클릭 반응을 MPLC C18 카트리지 컬럼에 직접 삽입합니다. 실행 시작 시 긴 세척 단계(약 100분)를 통합한 다음 최대 100% 용매 B까지 그라데이션을 실행한 다음 용매 A로 복귀합니다.참고: 용매 A는 용해도, 안정성 및 피크의 최상의 분해능에 따라 물, 물에 0.05-0.1% 포름산(FA), 물에 있는 0.05-0.1% 트리플루오아세트산(TFA)에서 선택할 수 있습니다. 용매 B는 아세토니트릴(ACN), ACN에서 0.05-0.1% FA, ACN에서 0.05-0.1% TFA로부터 선택되어 용매 A와 일치시킬 수 있다. 용출이 어렵다는 것이 입증되면, 메탄올은 ACN 대신에 사용될 수 있다. LCMS 및 색상(올바른 질량, 단수 피크)에 의해 표시된 바와 같이 적절한 분획을 수집하고 결합한 다음, (반)순수 형광 항생제를 주기 위해 동우성 화한다. 필요한 경우 제품을 추가로 정화하십시오. 스캐폴드에 적합한 컬럼 및 방법을 사용하여 NMR 및/또는 LCMS 및 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 순도를 평가합니다. 정화 방법 2참고 : 용해도가 허용하는 경우, 사전 정화는 수성 작업 (매크로 라이드, 게시되지 않은 작품, 돌 2019에 사용)에 의해 수행 될 수있다. 냉각된 클릭 반응을 물과 Et2O(초기 반응 량에서 약 10배 희석) 적절한 크기의 분리 깔때기로 옮기십시오. 층을 분리하고 Et2O로 수성 상을 두 번 세척하십시오. 결합 된 유기 상을 물 (유기 상과 동일한 부피)으로 2 배 씻은 다음 Na2SO4에서건조하십시오. 건조 된 유기 상을 필터링 하 고 감소 된 압력에서 농축. 2.4.4단계에서 설명한 대로 MPLC 및/또는 HPLC에 의해 원유 제품을 정제합니다.참고: 불완전하고 완전하며 정제된 클릭 반응 LCMS 추적의 예는 그림 2를 참조하십시오. 항생제 형광소 클릭 반응에 대한 전형적인 정제 수율은 30-80 %의 범위입니다.주의: 이러한 합성에 사용되는 대부분의 화학 물질은 특정 안전 위험을 가지고 있습니다. 개인 보호 장비 사용을 포함하여 항상 주의를 기울여야 합니다. Et2O, tBuOH, FA, 아세트산, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, 프로파가민, 및 HCTU는 모두 가연성; 열이나 스파크 소스와의 접촉을 피하십시오. THF, 프로파가민, DIPEA, t부오, FA, DMF, 및 PE는 모두 독성; 노출을 방지할 수 있습니다. 프로파가민, CsCO3,ZnCl2,LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, 아세트산 및 HCl은 모두 부식성; 접촉을 피하고 표면 접촉을 인식하십시오. ZnCl2,CuSO4,CuI 및 PE는 환경 적 위험을 제시합니다. 폐기 조건을 염두에 두어야 합니다. THF는 폭발성 과산화물을 형성할 수 있습니다. 보관 조건에 주의를 기울여야 합니다. 유기 아지드는 폭발성; 특히 대규모 생산에 주의를 기울여야 합니다. 3. 항균 활성 평가 참고: 박테리아와 관련된 모든 작업은 분석또는 실험실의 오염을 피하기 위해 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다. 모든 매체는 사용하기 전에 오토클레이브를 해야 하며, 플라스틱 제품 및 파이펫과 같은 장비는 멸균 상태로 보관해야 합니다. 생체 봉쇄 후드 (유형 2)에서 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 리소제니 육수 한천(LB, 제조사의 지시에 따라 제조됨)에 항생제 스캐폴드에 적합한 세균성 균주의 줄무늬 글리세롤 스톡은 37°C에서 하룻밤 사이에 자랍니다.참고 : 항균 활성을 테스트하는 박테리아의 선택은 사용되는 항생제 스캐폴드에 따라 이루어져야합니다. 5-10 박테리아의 대표적인 범위는 실험실의 물류 능력에 주어진 고려와 함께, 항생제에 취약 한 것으로 알려진 종에서 선택 되어야 한다. 가능 하면, 저항 하는 박테리아도 테스트 해야 합니다. 아래에 주어진 프로토콜은 대부분의 박테리아에서 작동하지만 특수 조건이 필요한지 확인 (예 : CO2, 특수 매체)을 확인하고 필요에 따라 변경하십시오. 이러한 조건을 사용하여 성공적으로 분석된 박테리아는 황색포도상구균, 연쇄상 구균, 바실리, 대장균, 클렙시엘라 폐렴, 슈도모나스 녹농균, 및 엔테로코커스 패시움을 포함한다. 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고, 5 mL의 양이온에서 밤새 배양하여 37°C에서 뮬러-힌튼 브로스(CAMHB, 제조사의 지시에 따라 제조)를 조정하였다. CAMHB에서 야간 배양액 ~40배를 희석하고 600 nm(OD600)= 0.4-0.8, 부피 5 mL에서 중간 로그 상, 광학 밀도로 성장한다. 멸균수에서 1.28 mg/mL에서 각 형광 항생제의 재고 용액을 준비하고, 96 웰 플레이트의 첫 번째 컬럼에 항생제의 피펫 10 μL을 준비합니다. 첫 번째 컬럼에 CAMHB 90 μL을 추가하고 다른 모든 웰에 50 μL을 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 가로 질러 직렬 2 배 희석을 수행합니다. 철저히 혼합한 다음 중간 로그 상 배양액을 ~10 6°C(CFU)/mL로 희석하고 모든 웰에 50 μL을 추가하여 ~5 x 105 CFU/mL의 최종 농도를 제공합니다.배양량(mL) = (mL의 미디어 볼륨)/(OD600 x 1,000)예를 들어, OD600 = 12 mL의 원하는 미디어 볼륨에서 0.5 배양에 대해, (12/(0.5 x 1,000) = 배양물 0.024 mL을 12 mL의 배지에 추가하십시오. 뚜껑으로 접시를 덮고 흔들리지 않고 18-24 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오. MIC가 눈에 띄는 성장 없이 가장 낮은 농도로 플레이트를 시각적으로 검사합니다.참고: 활성 및 비활성 형광 항생제의 몇 가지 예는 표 1을 참조하십시오. 4. 분광광도정 및 유동 세포측정법에 의한 프로브 축적 분석 참고 : 이러한 원심 분리 시간은 대장균에최적화되어 있으므로 다른 종에 약간의 변경이 필요할 수 있습니다. 프로브 축적을 위한 대표적인 데이터는 NBD 표지된 시프로플렉스사신 프로브에 대해 보고된다. 세균성 균주의 줄무늬 글리세롤 스톡을 LB 한천에 시키고 37°C에서 하룻밤 동안 자랍니다. 37°C에서 LB에서 하룻밤 동안 플레이트 및 배양으로부터 단일 콜로니를 선택한다. 하룻밤 배양액 ~50배 배지를 희석하고 중간 로그 상으로 성장한다(OD600 = 0.4-0.8). 25 분 동안 1,470 x g에서 문화를 원심 분리하고 미디어를 decant. 인산염 완충 식염수 (PBS)의 1 mL에서 박테리아를 다시 중단한 다음 15 분 동안 1,470 x g에서 원심 분리기를 하십시오. 미디어를 데낸트하고 최종 OD600 = 2로 PBS에서 세척된 펠릿을 재중단시켰다. 원하는 경우, 카보닐 시안화물 3-클로로페닐히드라존 10.1 μL(CCCP, PBS에서 10 mM)을 박테리아 1mL(최종 농도 100 μM)에 넣고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.참고: CCCP는 유출 펌프 억제제입니다. CCCP를 추가하면 유출의 영향을 검사 할 수 있습니다. 배양물 18,000 x g에서 20°C에서 4분 동안 배양하고 매체를 데언트한다. 펠릿에 형광 항생제 용액 1 mL (PBS에서 10-100 μM)을 넣고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 배양물 18,000 x g에서 4°C에서 7분 동안 배지를 데언트한다. 1 mL의 차가운 PBS에서 박테리아를 다시 중단하고 4.9 단계를 반복합니다. 단계 4.10을 총 4x반복합니다. 원하는 경우, 용해 완충액 180 μL(20 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 2 mM 나트륨 EDTA)을 첨가하여 박테리아를 70 μL의 리소자임(H2O에서 72 mg/mL)을 첨가하였다. 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 3x(-78°C에서 5분, 15분 동안 34°C)를 동결해 넣습니다. 샘플을 20분 동안 초음파 처리한 다음 65°C로 30분 동안 가열합니다. 용해 된 샘플 (18,000 x g,8 분)을 원심 분리한 다음 10 kDa 필터 멤브레인을 통해 필터링하십시오. 100 μL의 물로 필터를 4x 세척하십시오. 용해액을 평평한 바닥 검정 96 웰 플레이트로 옮기고 불소에 적합한 여기 및 방출 파장을 가진 플레이트 리더상에서 형광 강도를 측정합니다(즉, DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).참고: 형광 NBD 표지 된 시프로플록사신 항생제를 사용하여 박테리아의 분광광도 분석의 예는 그림 3을 참조하십시오. 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 동일한 성장 및 염색 조건(단계 4.1-4.17)을 최종 준비에서만 변경과 함께 사용할 수 있다. 총 볼륨을 PBS의 1mL로 가져옵니다. 데이터 수집을 위한 로거스믹 증폭을 사용하여 약 60 μL/min의 유량속도로 유량 세포계의 샘플을 판독합니다(F1 여기 = 488 nm; 방출 = 525/20 nm). 총 10,000개의 이벤트를 기록한 다음 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. F1의 형광 강도를 이벤트 수에 대해 플롯하여 박테리아가 염색된 후 히스토그램 피크의 중간 형광 강도를 추정합니다.참고: NBD 표지된 시프로플렉스사신 항생제를 사용하여 박테리아의 유동 세포분석 분석의 예는 그림 4를 참조하십시오. 5. 현미경 분석을 위한 준비 MIC 평가의 경우 하위 배양을 OD600 = 0.4로 성장한 다음 3-5분 동안 1mL aliquots 및 원심분리기로 18,000 x g으로 나눕니다. 데캔트 및 폐기 하 고 HBSS의 500 μL에서 세균 펠 릿을 다시 중단. 원심분리기는 3분 동안 18,000 x g으로, 미디어를 폐기합니다. 1-100 μM의 농도로 HBSS에서 항생제 프로브의 솔루션을 준비합니다. 세척된 박테리아를 프로브 용액의 500 μL에서 재중단하고, 37°C에서 30분 동안 배양한다. 5.3단계를 반복합니다. 다중 표지 실험을 위해, 직교 색핵산 염료의 500 μL에 펠릿을 다시 중단. 녹색의 경우 Syto9(HBSS에서 5 μM)를 사용합니다. 파란색의 경우 Hoechst 33342(HBSS에서 20 μg/mL)를 사용합니다. RT에서 15-30 분 동안 인큐베이션하십시오. 5.3단계를 반복한 다음 FM4-64FX(HBSS에서 5 μg/mL)의 500 μL로 다시 중단하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 5.3단계를 반복한 다음 HBSS 500 μL에서 다시 일시 중단하고 5.3단계를 다시 반복합니다. 5.8단계를 반복한 다음, 마침내 세척된 염색된 박테리아를 장착 매체의 15 μL로 중단시켰다(재료 표참조). 현미경 슬라이드에 피펫 장착 매체와 고성능 커버 슬립 상단, 다음 명확한 매니큐어로 가장자리를 밀봉.참고: NBD 표지된 시프로플렉스와 트리메토프림 항생제로 촬영한 공초점 현미경 이미지의 예와 DMACA 표지된 옥사졸리딘(라인졸리드) 항생제에 대한 그림 6을 참조하십시오.