Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti

1. Sintesi di Alkyne-fluorofori Sintesi di NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine) Sciogliere 1.031 mg di 4-chloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) in 60 mL di tetraidrofuran (THF). Aggiungere 1.857 mg di CsCO3 (5.696 mmol), quindi 0,39 mL di propargylamina (6.1 mmol). Riscaldare la reazione a 50 gradi centigradi per 2 h, che si trasformerà da marrone a verde, quindi raffreddare a temperatura ambiente (RT). Filtrare la reazione utilizzando un ausilio filtrante (vedere Tabella dei materiali)e lavare con acetato etilico (EA). Concentrare il filtrato a pressione ridotta, quindi sciogliere il residuo in 150 mL di EA e passare a un imbuto di separazione di 500 mL. Lavare la soluzione EA con 100 mL rispettivamente con acqua e salamoia. Quindi combinare le fasi acquose e lavare 2x con 100 mL di EA. Asciugare le fasi organiche combinate sopra il solfato di magnesio anidroso, quindi filtrare e concentrarsi sotto pressione ridotta. Purificare il prodotto greggio mediante cromatografia flash su gel di silice (20-30% EA nell’etere petrolifero [PE]), controllando la purezza mediante spettrometria di massa della cromatografia liquida (LCMS, [M-H]- 219,1) e/o spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), sposta chimica come segue:1 : il nome del H NMR (CD3OD, 600 MHz) che svago 8,54 (d, J – 8,7 Hz, 1 H), 6,35 (d, J – 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J – 5,7 Hz, J – 2,5 Hz, 2 H), 2,43 (t, J – 2,5 Hz, 1H); 13 del sistema C NMR (CD3OD, 150 MHz) 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.NOTA: Quando si esegue la purificazione mediante cromatografia gel di silice, preparare la colonna utilizzando il meno polare dei solventi elencati. Il composto grezzo può essere caricato come soluzione concentrata o adsorbito sulla silice se la solubilità non lo consente. Dopo che il composto è stato aggiunto alla parte superiore della silice, eseguire attraverso 1–2 volumi di colonna dello stesso solvente utilizzato per bagnare la silice. Quindi iniziare con il rapporto di solvente elencato, che attraversa almeno 1 volume di colonna di ogni solvente, e assicurandosi di non fare grandi salti nella composizione del solvente. Raccogliere le frazioni e verificare la purezza/identità mediante LCMS o TLC (cromatografia a strati sottili). Unire le frazioni pure e concentrare sotto pressione ridotta per evaporazione rotante. Sintesi di DMACA-alkyne (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).Scioglire 5,02 g di 3-(dimetilamino)fenolo (36,6 mmol) in 30 mL di etanolo, quindi aggiungere 6,7 mL di dietil 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Aggiungete 10,5 g di nCl2 (77,2 mmol), quindi reflusso della soluzione rossa per 42 h. Aggiungere ulteriori 9,20 g di nCl2 (67,6 mmol), quindi reflusso per 8 h. Raffreddare la reazione e concentrarsi sotto pressione ridotta. Disperdere il solido rosso risultante in 200 mL di EA, filtrare, quindi trasferire a un imbuto di separazione 500 mL. Lavare l’EA con 200 mL ciascuno di acqua e salamoia, quindi asciugare sopra il solfato di magnesio idroelettrico. Filtrare la fase organica essiccata e concentrarsi sotto pressione ridotta. Purificare il solido rosso (ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)aceto) con la cromatografia flash su gel di silice (0-100% EA in PE), controllando la purezza da parte di LCMS ([M-H]- 275,1) e/o NMR, spostare i prodotti chimici come segue:1 : il nome del H NMR (CDCl3, 600 MHz) 7,30 (d, J – 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J – 8,9 Hz, J – 2,6 Hz), 1,40 (d, J – 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J – 1,2 Hz, 3H). Sciogliere 488 mg di etilo 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)aceato (1,18 mmol) in 10 mL di THF, quindi aggiungere una soluzione di 157 mg di LiOH H2O (3,74 mmol) in 15 mL d’acqua. Mescolare la reazione a RT per 3 h, quindi passare a un imbuto di separazione e diluire con ulteriori 50 mL di acqua. Lavare la miscela di reazione 2x con 50 mL di etere dietillo (Et2O), quindi lavare la fase organica combinata 2x con 25 mL di acqua. Prendere qualsiasi precipitato giallo con lo strato organico. Concentrare la fase organica a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Acidifiare la fase acquosa a pH 2 con HCl concentrato, e raffreddare a 4 gradi durante la notte. Filtrare la fase acquosa acidificata e aggiungere il solido giallo alla fase organica concentrata.NOTA: L’acido acetico 2-(7-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) può essere utilizzato senza ulteriore purificazione, ma questo può essere controllato da LCMS ([M-H]- 247,1) e/o NMR, spostamenti chimici come segue:1 : il nome del H NMR (CDCl3, 600 MHz) 7,41 (d, J – 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J – 9,2 Hz, J – 2,8 Hz), 1,82 (d, J , 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J – 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J – 0,9 Hz, 2H); 13 del sistema C NMR (CDCl3, 150 MHz) 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5. Sciogliere 466 mg di 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) acido acetico (1,89 mmol) in 7 mL di secco N,N-dimethylformamide (DMF) e posizionare sotto un’atmosfera di azoto. Sciogliere 0,33 mL di propargylamina (5,1 mmol) in 7 mL di DMF secco sotto azoto. Aggiungere 1,30 mL di ammina di-isopropiletilo (DIPEA, 7,50 mmol) alla soluzione di tintura, quindi 535 mg di O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramelutibro exafluorophosphate (HCTU, 1.29mmol). Mescolare la soluzione di tintura attivata per 15 min a RT, quindi aggiungere la soluzione di ammina dropwise, e lasciare mescolare durante la notte. Il giorno successivo, diluire la reazione con 35 mL di acqua poi concentrarsi sotto pressione ridotta. Partizionare il solido arancione risultante tra EA e salamoia (100 mL ciascuno) in un imbuto di separazione di 250 mL. Separare gli strati (eseguire i due strati in diversi flaconi) e lavare la fase acquosa con 100 mL di EA. Concentrare le fasi organiche combinate sotto pressione ridotta, quindi risciogliete il solido arancione in 3 mL di 1:1 acetonitrile (ACN)/acqua (v/v). Purificare il prodotto grezzo iniettando su un sistema di cromatografia liquida a media pressione in fase inversa (MPLC) dotato di una colonna di cartuccia C18 (solvente A: acqua, solvente B: ACN). Controllare le frazioni per la purezza da parte di LCMS ([M-H]- 284.1, spostamenti chimici NMR riportati di seguito), quindi combinare e licifilizzare le frazioni appropriate per dare 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)aamide, NMR chemicals come segue:1 : il nome del H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 8,65 (t, J – 5,4 Hz), 7,52 (d, J 1 H), 6,72 (dd, J – 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J – 2,6 Hz, 1 H), 6,00 (s, 1 H), 3.88–3.87 (m, 2.62 (s, 2H), 3.13 (t, J – 2.5 Hz, 1H), 3.00 (s, 1H), 3.00). 13 del sistema C NMR (125 MHz, DMSO-d6)- 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108,1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,4, 28,2. 2. Sintesi degli antibiotici fluorescenti Preparare un azide-derivato di un antibiotico come descritto in precedenza14,15,16.NOTA: La procedura è specifica per ogni antibiotico e richiede un attento esame del rapporto di attività della struttura (SAR) della molecola madre per garantire che l’antibiotico funzionalizzato mantenga un’attività paragonabile alla controllante. (ad esempio, ciprofloxacin16, linezolid14e trimethoprim15). Vedere la figura 1 per esempi di antibiotici fluorescenti pubblicati e lo schema di sintesi generale. Procedura di reazione click ANOTA: Per la maggior parte degli antibiotici, seguire la procedura descritta qui per il rame catalyzato Huisgen [2×3] cicloaddition di azide (passaggio 2.1) e alchino fluorescente (preparato nel passaggio 1). Mettere l’antibiotico dell’azide in un pallone rotondo in basso e aggiungere tert-butanol (tBuOH) e acqua (1:1 v/v, 25 mL ciascuno per azide mmol). Aggiungere il fluoroforo-alkyne preparato al punto 1.1 (3 eq.) e riscaldare la reazione a 50 gradi centigradi. Aggiungere quindi il solfato di rame (100 mM in acqua, 0,6 eq.) alla reazione, seguito dall’acido ascorbico (500 mM in acqua, 2,4 eq.). Mescolare la reazione a 50 gradi centigradi per 1 h, o fino all’analisi di LCMS su indicazione del completamento della reazione (consumo completo di azide iniziale). Raffreddare la reazione e purificare a seconda dell’impalcatura antibiotica e procedere per la purificazione al passo 2.3 o 2.4.NOTA: Sono possibili diversi metodi di purificazione, a seconda della polarità e della stabilità dell’impalcatura. Procedura di reazione click BNOTA: Seguire questa procedura per gli antibiotici a base di peptidi, per fornire condizioni di reazione più forti (lavoro inedito, Phetsang, 2019). Mettere l’azide-antibiotico peptide in una fiaschetta inferiore rotonda e aggiungere abbastanza DMF (750 mL/mmol azide) per sciogliere. Aggiungere il fluoroforo-alkyne preparato al punto 1 (5 eq.) e riscaldare la reazione a 50 gradi centigradi per 1 h. Aggiungere rame (I) ioodio (20 eq.), quindi DIPEA (120 eq.), quindi acido acetico (240 eq.). Mescolare la reazione a 50 gradi centigradi per 1 h, o fino a quando l’analisi di LCMS indica il completamento della reazione (cioè il consumo completo di azide iniziale). Raffreddare la reazione e procedere per la purificazione con il metodo 1 (vedere il punto 2.3). Metodo di purificazione 1 (utilizzato per ciprofloxacin, trimethoprim e linezolid) Iniettare la reazione di clic raffreddato direttamente su una colonna di cartuccia MPLC C18. Incorporare una lunga fase di lavaggio (circa 10 min) all’inizio della corsa (100% solvente A), quindi eseguire un gradiente fino al 100% solvente B, seguito da un ritorno al solvente A.NOTA: Il solvente A può essere scelto dall’acqua, 0,05–0,1% di acido formico (FA) in acqua, 0,05–0,1% acido trifluoroacetico (TFA) in acqua, a seconda della solubilità, della stabilità e della migliore risoluzione dei picchi. Il Solvente B può essere scelto tra acetonitrile (ACN), 0,05-0,1% FA in ACN, 0,05-0,1% TFA in ACN, per abbinare il solvente A. Se l’eluizione si rivela difficile, il metanolo può essere utilizzato al posto di ACN. Raccogliere e combinare le frazioni appropriate, come indicato da LCMS e colore (massa corretta vista, picco singolare), quindi liofilizzare per dare l’antibiotico fluorescente (semi)puro. Se necessario, purificare ulteriormente il prodotto. Valutare la purezza da NMR e/o LCMS e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), utilizzando una colonna e un metodo appropriati per lo scaffold. Metodo di purificazione 2NOTA: Se la solubilità lo consente, la prepurificazione può essere effettuata dall’acquisivo lavoro (utilizzato per macrolidi, lavori inediti, Stone 2019). Diluire la reazione di clic raffreddato con acqua ed Et2O (1:1 v/v, circa 10 volte diluizione dal volume di reazione iniziale), trasferendo ad un imbuto di separazione di dimensioni adeguate. Separare gli strati e lavare due volte la fase aqueous con Et2O. Lavare le fasi organiche combinate 2x con acqua (uguale volume con fase organica), quindi asciugare su Na2SO4. Filtrare la fase organica essiccata e concentrarsi sotto pressione ridotta. Purificare il prodotto grezzo da MPLC e/o HPLC come descritto al punto 2.4.4.NOTA: vedere la figura 2 per esempi di tracce LCMS di reazione a scatto incomplete, complete e purificate. Le tipiche rese purificate per le reazioni di clic antibiotico-fluoroforo vanno dal 30 all’80%.AVVISO: La maggior parte delle sostanze chimiche utilizzate in queste sintesi possiedono rischi specifici per la sicurezza. Occorre prestare attenzione in ogni momento, compreso l’uso di dispositivi di protezione personale. Et2O, tBuOH, FA, acido acetico, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamine e HCTU sono tutti infiammabili; evitare il contatto con sorgenti di calore o scintille. THF, propargylamine, DIPEA, tBuOH, FA, DMF e PE sono tutti tossici; evitare l’esposizione. Propargylamine, CsCO3, nCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, acido acetico, e HCl sono tutti corrosivi; evitare il contatto ed essere consapevoli del contatto superficiale. NCl2, CuSO4, CuI e PE presentano rischi ambientali; tenere presente le condizioni di smaltimento. IL THF può formare perossidi esplosivi; fare attenzione con le condizioni di conservazione. Gli azidi organici sono esplosivi; prestare attenzione soprattutto con la produzione su larga scala. 3. Valutazione dell’attività antimicrobica NOTA: Tutti i lavori che coinvolgono batteri devono essere eseguiti in condizioni sterili per evitare la contaminazione del saggio o del laboratorio. Tutti i supporti devono essere autoclavi prima dell’uso, e plasticware e attrezzature come pipette devono essere mantenuti sterili. Si raccomanda di lavorare in un cofano di biocontenimento (tipo 2). Streak glicerol stock di ceppi batterici appropriati per l’agar di brodo di lisogenia antibiotico su agar di lisogenesi (LB, preparato per istruzioni del produttore), e crescere durante la notte a 37 .NOTA: La scelta dei batteri per testare l’attività antibatterica deve essere effettuata in base all’scaffold antibiotico utilizzato. Una gamma rappresentativa di 5-10 batteri dovrebbe essere scelta tra le specie che sono noti per essere suscettibili all’antibiotico, tenendo conto delle capacità logistiche del laboratorio. Se possibile, devono essere testati anche batteri resistenti. Il protocollo riportato di seguito funzionerà sulla maggior parte dei batteri, ma controlla se sono necessarie condizioni speciali (ad esempio, CO2, supporti speciali) e farà delle modifiche se necessario. I batteri analizzati con successo usando queste condizioni includono Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecium. Scegli una singola colonia dalla piastra, e la cultura durante la notte in 5 mL di cation regolato Mueller-Hinton Broth (CAMHB, preparato per istruzioni del produttore) a 37 gradi centigradi. Diluiare le colture notturne di 40 volte in CAMHB e crescere fino a una fase intermedia del log, densità ottica a 600 nm (OD600) – 0,4–0,8, volume 5 mL). Preparare le soluzioni di riserva di ogni antibiotico fluorescente a 1,28 mg/mL in acqua sterile, e pipetta 10 -L di antibiotico alla prima colonna di una piastra di 96 pozze. Aggiungere 90 l di CAMHB alla prima colonna e 50 l in tutti gli altri pozzi. Quindi, eseguire la diluizione seriale di 2 volte attraverso la piastra. Mescolare accuratamente, quindi diluire le colture di fase mid-log a 106 unità formanti colonia (CFU)/mL e aggiungere 50 L a tutti i pozzi, per fornire una concentrazione finale di 5 x 105 CFU/mL.volume di impostazioni cultura (mL) (volume multimediale in mL)/(OD600 x 1.000)ad esempio, per una coltura OD600 – 0,5 in un volume multimediale desiderato di 12 mL, aggiungere (12/(0,5 x 1.000) : 0,024 mL di coltura a 12 mL di supporti Coprire le piastre con i coperchi e incubare a 37 gradi centigradi per 18-24 h senza agitare. Ispezionare visivamente le piastre, con il MIC che è il pozzo di concentrazione più basso senza crescita visibile.NOTA: Vedere la tabella 1 per alcuni esempi di antibiotici fluorescenti attivi e inattivi. 4. Analisi dell’accumulo di sonde mediante spettrofotometria e citometria di flusso NOTA: Questi tempi di centrifugazione sono stati ottimizzati per E. coli, quindi potrebbero essere necessarie lievi modifiche per altre specie. Per la sonda di sonda fucilosa con etichetta NBD vengono riportati dati rappresentativi per l’accumulo di sonde. Le scorte di glicerolo Streak dei ceppi batterici sull’agar LB e crescono durante la notte a 37 gradi centigradi. Scegli una singola colonia dal piatto e la cultura durante la notte in LB a 37 gradi centigradi. Diluire le colture notturne di 50 volte nei media e crescere fino alla fase intermedia del log (OD600 – 0,4–0,8). Centrifugare le culture a 1.470 x g per 25 min e decantare i media. Risospendere i batteri in 1 mL di salina tampone fosfata (PBS), quindi centrifugare a 1.470 x g per 15 min. Decant il supporto e risospendere i pellet lavati in PBS fino a un ODfinale 600 x 2. Se lo si desidera, aggiungere 10,1 o L di cianuro di carbonio 3 clorophenylhydrazone (CCCP, 10 mM in PBS) a 1 mL di batteri (concentrazione finale 100 M) e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.NOTA: CCCP è un inibitore della pompa di efflusso. L’aggiunta di CCCP consentirà l’esame dell’impatto dell’efflux. Centrifugare le colture a 18.000 x g per 4 min a 20 gradi centigradi e decantare i media. Aggiungere al pellet 1 mL di soluzione antibiotica fluorescente (10-100 m in PBS) e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min. Centrifugare le colture a 18.000 x g per 7 min a 4 gradi centigradi e decantare i media. Risospendere i batteri in 1 mL di PBS freddo e ripetere il passaggio 4.9. Ripetere il passaggio 4.10 per un totale di 4x. Se lo si desidera, liscizzai i batteri aggiungendo 180 l of lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 2 mM di sodio EDTA) quindi 70 l di lisozyme (72 mg/mL in H2O). Incubare a 37oC per 30 min, quindi congelare-disgelo 3x (78 gradi centigradi per 5 min, poi 34 gradi C per 15 min). Sonicare i campioni per 20 min, poi riscaldare a 65 gradi centigradi per 30 min. Centrifugare i campioni di lisming (18.000 x g, 8 min), quindi filtrare attraverso una membrana di filtro 10 kDa. Lavare il filtro 4x con 100 ll di acqua. Trasferire il lisfatto su una piastra nera piatta 96 e misurare l’intensità della fluorescenza su un lettore di lastre con lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione appropriate per il fluoroforo (cioè DMACA: s400 nm,e – 490 nm; NBD:475 nm,545 nm.NOTA: Vedere la figura 3 per esempi di analisi spettrofotometriche di batteri che utilizzano l’antibiotico fluorescente con etichetta nbfloxacin. Per l’analisi per citometria di flusso, possono essere utilizzate le stesse condizioni di crescita e colorazione (passaggi da 4.1 a 4,17), con variazioni esclusivamente nella preparazione finale. Portare il volume totale a 1 mL di PBS. Leggere i campioni su un citometro di flusso a una velocità di flusso di circa 60 l/min, utilizzando l’amplificazione logaritmica per l’acquisizione dei dati (eccitazione F1 – 488 nm; emissione – 525/20 nm). Registrare un totale di 10.000 eventi, quindi analizzare i dati utilizzando il software appropriato. Tracciare l’intensità della fluorescenza da F1 rispetto al numero di eventi conta, stimando l’intensità mediana della fluorescenza dai picchi dell’istogramma dopo che i batteri sono stati macchiati.NOTA: Vedere la figura 4 per esempi di analisi della citometria di flusso di batteri che utilizzano l’antibiotico ciprofloxacina con etichetta NBD. 5. Preparazione per l’analisi microscopica Coltivare le sottocolture fino a0,4 OD, per quanto riguarda la valutazione MIC, quindi dividere in 1 mL e centrifugare a 18.000 x g per 3-5 min. Decant e scartare i supporti, quindi risospendere il pellet batterico in 500 gradi l di HBSS. Centrifuga a 18.000 x g per 3 min, quindi decant e scartare i supporti. Preparare soluzioni di sonde antibiotiche in HBSS a concentrazioni di 1-100 M. Risospendere i batteri lavati a 500 gradi della soluzione della sonda e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min. Ripetere il passaggio 5.3. Per un esperimento di etichettatura multipla, risospendere il pellet in 500 litri di un coloracido nucleico color ortogonale. Per il verde, utilizzare Syto9 (5 m in HBSS); per il blu, utilizzare Hoechst 33342 (20 g/mL in HBSS). Incubare a RT per 15-30 min. Ripetere il passaggio 5.3, quindi risospendere in 500 : L di FM4-64FX (5 g/mL in HBSS) e incubare a RT per 5 min. Ripetere il passaggio 5.3, quindi risospendere in 500 gradi l di HBSS e ripetere nuovamente il passaggio 5.3. Ripetere il passaggio 5.8, quindi sospendere infine i batteri lavati e tinto in 15 : L del supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali). Supporto di montaggio pipetta su un vetrino e piano con un coperchio ad alte prestazioni, quindi sigillare i bordi con smalto trasparente.NOTA: Vedere la figura 5 per esempi di immagini di microscopia confocale scattate con antibiotici ciprofloxacin e trimethoprim con etichetta NBD e Figura 6 per l’antibiotico oxazolidinone con etichetta tamponato DMACA (linezolid).