Aqui, descrevemos uma estratégia simples e acessível para visualizar, quantificar e mapear células imunes em seções de tecido tumoral parafina fixada em formalina. Essa metodologia combina técnicas de imagem e análise digital existentes com o objetivo de ampliar a capacidade de multiplexação e a análise multiparâmetro de ensaios de imagem.
A paisagem imunológica do microambiente tumoral (TME) é um fator determinante na progressão do câncer e na resposta à terapia. Especificamente, a densidade e a localização das células imunes no TME têm importantes valores diagnósticos e prognósticos. O perfil multiômico do TME aumentou exponencialmente nossa compreensão das numerosas redes celulares e moleculares que regulam a iniciação e a progressão tumoral. No entanto, essas técnicas não fornecem informações sobre a organização espacial das células ou interações células. Técnicas de multiplexação acessíveis, acessíveis e fáceis de executar que permitem a resolução espacial de células imunes em seções teciduais são necessárias para complementar tecnologias de alto throughput baseadas em células únicas. Aqui, descrevemos uma estratégia que integra imagens seriais, rotulagem seqüencial e alinhamento de imagens para gerar slides multiparâmetrovirtuais de seções de tecidos inteiros. Os slides virtuais são posteriormente analisados de forma automatizada usando protocolos definidos pelo usuário que permitem a identificação, quantificação e mapeamento de populações celulares de interesse. A análise de imagem é feita, neste caso, utilizando os módulos de análise Tissuealign, Author e HISTOmap. Apresentamos um exemplo em que aplicamos essa estratégia com sucesso a uma amostra clínica, maximizando as informações que podem ser obtidas a partir de amostras limitadas de tecidos e fornecendo uma visão imparcial do TME em toda a seção de tecidos.
O desenvolvimento do câncer é resultado de um processo multietapa envolvendo interações recíprocas entre células malignas e o TME. Além das células tumorais, o TME é composto por células não-malignas, células estrômicas, populações de células imunes e matriz extracelular (ECM)1. A organização espacial dos diferentes componentes celulares e estruturais do tecido tumoral e a troca dinâmica entre o câncer e as células não cancerosas vizinhas, em última análise, modulam a progressão do tumor e a resposta à terapia2,3,4. Foi demonstrado que a resposta imune no câncer é regulada espacialmente5,6. Diferentes populações de células imunes infiltrando-se na lesão neoplásica e no tecido adjacente exibem padrões de distribuição espacial distintos e estados variados de ativação e diferenciação associados a diferentes funções (por exemplo, pró- versus antitumor). Essas diferentes populações imunológicas e seus parâmetros coevoluem horas extras com o tumor e os compartimentos estrômicos.
O surgimento de tecnologias que permitem o perfil multimômico de células únicas aumentou exponencialmente nossa compreensão das inúmeras redes celulares e moleculares que regulam a carcinogênese e a progressão tumoral. No entanto, a maioria das ferramentas analíticas de alto throughput baseadas em células únicas requerem interrupção tecidual e isolamento de células únicas, resultando em perda de informações sobre a organização espacial das células e interaçõescélulas-células 7. Como a localização e o arranjo de células imunes específicas no TME têm valor diagnóstico e prognóstico, as tecnologias que permitem a resolução espacial são um complemento essencial das técnicas de perfil imunológico baseadaem em células únicas.
Tradicionalmente, técnicas de imagem como imunohistoquímica (IHC) e imunofluorescência multiplex (mIF) têm sido restritas a um pequeno número de biomarcadores que podem ser visualizados simultaneamente. Essa limitação tem dificultado o estudo da dinâmica espacial das células imunes infiltradas em tumores, que são tipicamente definidas por vários marcadores fetotípicos. Os recentes avanços em imagens e ferramentas analíticas ampliaram as possibilidades de multiplexação. Novas tecnologias de rotulagem baseadas em anticorpos, como a citometria da histocitometria e a citometria de massa de imagem, têm sido usadas para separar espacialmente até 12 e 32 biomarcadores, respectivamente8,9. A imagem de espectrometria de massa, uma técnica que não requer rotulagem, tem o potencial de visualizar milhares de biomarcadores simultaneamente em uma única seção tecidual10,11. Embora essas técnicas já tenham mostrado grande potencial para dissecar a paisagem imunológica do tecido no câncer, elas usam equipamentos e softwares altamente sofisticados e caros e não são facilmente acessíveis à maioria dos pesquisadores.
Alternativamente, a capacidade de multiplexação do IHC tradicional e do IFM foi expandida através do uso de imagens seriais, rodadas seqüenciais de rotulagem e imagens espectrais7,,12,,13,14,15,16. Essas técnicas geram múltiplas imagens a partir das mesmas ou de seções de tecido serial que podem ser consolidadas em slides de multiparâmetros virtuais usando software de análise de imagem. Como resultado, o número de marcadores que podem ser visualizados e analisados simultaneamente aumenta.
Aqui, propomos uma estratégia para o design racional de ensaios multiplex de tecido usando reagentes disponíveis comercialmente, equipamentos de microscopia acessíveis e software fácil de usar(Figura 1). Essa metodologia integra imagens seriais, rotulagem multiplex sequencial, imagem de tecido inteiro e alinhamento de tecidos para gerar slides multiparâmetrovirtuais que podem ser usados para quantificação automatizada e mapeamento de células imunes em seções teciduais. Usando essa estratégia, criamos um slide virtual composto por 11 biomarcadores mais duas manchas histológicas frequentemente utilizadas: hematoxilina e eosina (H&E) e picrosirius vermelho (PSR). Várias populações de células imunes foram identificadas, localizadas e quantificadas em diferentes compartimentos teciduais e sua distribuição espacial resolvida usando mapas térmicos teciduais. Essa estratégia maximiza as informações que podem ser obtidas a partir de amostras clínicas limitadas e é aplicável a amostras de tecido saqueado por parafina (FFPE) embutidas por parafina (FFPE), incluindo tecido inteiro, biópsias de agulhas e micromatrizes de tecido. Propomos essa metodologia como um guia útil para a concepção de ensaios personalizados para identificação, quantificação e mapeamento de populações de células imunes no TME.
Técnicas simples, acessíveis e fáceis de executar multiplexantes que permitam a resolução espacial de células imunes em seções teciduais são necessárias para mapear a paisagem imunológica em câncer e outras doenças imunológicas. Aqui, descrevemos uma estratégia que integra técnicas de rotulagem e análise digital amplamente disponíveis para ampliar a capacidade de multiplexação e avaliação multidimensional dos ensaios de imagem12,,13,,17,,19. A coloração de três seções seriais para diferentes marcadores, e o reaproveitamento de seções através de técnicas de descascamento e ressarência, nos permitiu visualizar 11 parâmetros, além de manchas de H&E e PSR. Seis imagens dessas seções foram alinhadas de forma automatizada usando o módulo de alinhamento de tecidos. O alinhamento foi preciso no nível individual da célula para imagens originárias da mesma seção e altamente concordante para imagens originárias de seções vizinhas. O multiplexação virtual nos permitiu determinar como os marcadores visualizados em uma seção se relacionam espacialmente com marcadores visualizados em outra seção contígua. Enquanto algumas das manchas rotularam COIs, outras rotularam TCs, permitindo-nos quantificar COIs nos diferentes TCs. O uso de ferramentas de software para a quantificação automatizada de COIs simplificou e acelerou muito o processamento de imagens. Além disso, a análise digital foi aplicada em seções de tecidos inteiros em vez de campos de visão selecionados, resultando em uma representação imparcial do TME. Além disso, como as coordenadas teciduais dos COIs foram registradas, foi possível gerar mapas de calor tecidual.
Existem várias áreas neste protocolo onde a solução de problemas pode ser necessária. Em primeiro lugar, a má recuperação de antígenos pode afetar a qualidade do IFM, portanto, o tipo de buffer de recuperação de antígenos e a duração devem ser otimizados para as condições específicas de ensaio/biomarcador utilizados. Em segundo lugar, o tipo de solução de bloqueio utilizada deve ser adaptado aos tecidos/antígeno/espécie de anticorpos primários e secundários. Em nossas mãos, a adição de 10% do soro total da espécie onde o tecido vem de receptores Fc bloqueados, e, portanto, reduziu a ligação de anticorpos inespecíficos. A adição de 10% do soro da espécie em que os anticorpos secundários foram levantados minimizaria a fixação direta e inespecífica de anticorpos secundários à seção tecidual. Em terceiro lugar, a validação da especificidade dos anticorpos primários e secundários utilizando os controles positivos e negativos adequados é essencial. Em quarto lugar, o aumento da autofluorescência em alguns canais e a difusão de DAPI sobre a desmontagem de anticorpos primários também são comuns. Para abordar a autofluorescência aprimorada, usamos pares de anticorpos primários/secundários onde o sinal específico tinha valores de intensidade pelo menos 5x os do fundo. Finalmente, alguns anticorpos de alta afinidade não podem ser eluidos com procedimentos regulares de desmontagem. Neste caso, recomendamos o uso desses anticorpos na última rodada de rotulagem. O usuário pode ter que tentar diferentes seqüências de coloração para encontrar a configuração ideal para os anticorpos de interesse. A eficiência da descascamento deve ser confirmada antes de prosseguir para uma segunda ou terceira rodada de rotulagem.
A principal limitação e desafio dessa estratégia é encontrar as combinações certas de anticorpos fluorescentes primários e secundários para os marcadores de interesse. Encontrar anticorpos primários criados em diferentes espécies ou com diferentes iótipos que poderiam ser usados simultaneamente é limitado pelo que está comercialmente disponível. A maioria dos scanners de slides inteiros são equipados com lâmpadas e filtros que permitem a imagem de no máximo cinco canais, e anticorpos secundários nas espécies certas e fluoróforos certos nem sempre estão disponíveis. Superamos parcialmente essas limitações usando manchas seriais e rotulagem seqüencial. Várias combinações de anticorpos podem precisar ser testadas para chegar à melhor combinação para os marcadores de interesse. Outra limitação é a qualidade da coloração da DAPI, pois a descascamento e a resondagem podem nem sempre permitir a realização da segmentação de núcleos.
O módulo de alinhamento de tecidos requer treinamento mínimo e nenhuma habilidade de programação dos usuários. O software teoricamente permite o alinhamento de um número ilimitado de imagens. No entanto, o alinhamento preciso depende da relação das seções, onde seções mais próximas que são mais histologicamente concordantes estão mais alinhadas com mais precisão. Utilizou-se o módulo Autor do VIS para a geração dos APPs. O conhecimento básico da análise de imagens é necessário para a criação de APPs, mas este é igualmente o caso ao usar qualquer outro software de análise de imagem. As vantagens únicas do VIS em comparação com outros softwares de análise de imagens incluem alinhamento automatizado de imagens de seções preparadas usando diferentes métodos (por exemplo, IF, histoquímica, IHC). Isso permite estudos de colocalização de múltiplos marcadores de interesse usando multiplexação virtual. Além disso, o design flexível e fácil de usar de APPs permite personalização específica do usuário. Quantificação e mapeamento automatizados, e a possibilidade de processar seções de tecidos inteiros, economiza tempo e reduz o viés em comparação com a contagem manual por inspeção visual.
Essa estratégia é uma ferramenta de pesquisa muito útil para a imunologia tecidual no contexto do câncer e da autoimunidade, mas permanece invalidada para uso clínico. Com padronização e validação adicionais, pode ser usado no futuro para múltiplas aplicações (por exemplo, mapear a paisagem imunológica do câncer para prever e monitorar a resposta a agentes imunoterapêuticos). Também pode ser adaptado a diferentes condições inflamatórias (por exemplo, doença inflamatória intestinal) para combinar avaliação patológica com biomarcadores prognósticos.
As principais etapas críticas deste protocolo são a eficiência/especificidade da rotulagem e a robustez dos APPs projetados para o uso pretendido ou biomarcador. Por isso, a validação regular por inspeção visual, especialmente na concepção de um novo APP, é essencial. O uso eficiente de múltiplas rodadas de descascamento e resplanagem ou diferentes tipos de manchas na mesma seção são componentes críticos e podem ser específicos do tecido ou da seção. Verificar a eficiência desses processos antes de prosseguir com a análise de grandes lotes é fundamental.
Em resumo, fornecemos uma estratégia que maximiza as informações quantitativas e espaciais que podem ser obtidas a partir de valiosas amostras de tecido clínico. Os recursos, equipamentos e conhecimentos necessários para implementar essa metodologia são amplamente acessíveis. Propomos essa metodologia como um guia útil para o planejamento de ensaios com o objetivo de identificar, quantificar e mapear populações de células imunes no TME.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao participante do estudo. Agradecemos a Louise Rousseau, coordenadora do biobanco hbp pela recuperação das amostras de tecidos e todas as informações clínicas associadas. Reconhecemos as instalações do núcleo de patologia molecular e imagem celular no CRCHUM e Michael Persch de Visiopharm para excelente assistência técnica. Financiamento: Este estudo foi apoiado por subsídios da Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS e Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI), e da Rede Canadense de Hepatite C (CanHepC). O CanHepC é financiado por uma iniciativa conjunta dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (NHC-142832) e da Agência de Saúde Pública do Canadá. M.F.M. recebeu bolsas da Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis, e do FRQS. T.F. recebeu bolsas de doutorado do CIHR e canHepC. S.T. ocupa a Cadeira Roger-Des-Groseillers em cirurgia oncológica hepatobiliária e pancreática, Université de Montréal.
Contribuições do autor: M.F.M. projetou, realizou experimentos e analisou dados. T.F. projetou experimentos. A.C.B. forneceu orientação técnica. A G.S. realizou toda a avaliação patológica do sujeito do estudo e forneceu informações sobre todos os aspectos patológicos. A L.M. realizou a coloração de H&E, otimizou e realizou a aquisição de imagens. M.N.A. realizou a mancha PSR e forneceu informações técnicas valiosas. N.B. contribuiu para a análise da imagem. S.T. é o principal investigador do biobanco HBP e é responsável por supervisionar a operação geral do biobanco. Ele também forneceu informações inestimáveis sobre todos os aspectos do projeto e suas implicações clínicas. M.F.M., T.F., e N.H.S. conceituaram e projetaram o estudo. N.H.S. supervisionou o trabalho e obteve financiamento. M.F.M., T.F., A.C-B e N.H.S. escreveram o manuscrito. Todos os autores revisaram e aprovaram o manuscrito.
Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Ethanol 100% | |||
Electric pressure cooker | Salton | ||
Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
FFPE section (4μm) slides | |||
Glycine 0,1 M in PBS | |||
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
Human Serum | Gemini | 22210 | |
Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
Pap pen | abcam | ab2601 | |
PBS | |||
PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Shaking water bath | |||
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
VIS Software | Visiopharm | ||
Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |