Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Hayvanları içeren tüm çalışmalar, William ve Mary Koleji’ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Hayvan Bakımı ve Embriyo Kullanımı Yetişkin Xenopus laevis dorsal lenf kesesi içine insan koryonik gonadotropin bir deri altı enjeksiyon (HCG) uygulayarak doğal çiftleştirme indüklemek 600 U bir dozda kadınlar için ve 400 U erkekler için. Enjeksiyondan sonra, bir gece boyunca oda sıcaklığında tutma tankına en az bir erkek ve bir dişi kurbağa yerleştirin. Yumurtlama genellikle HCG uygulamasından sonra 9-12 saat başlar. Embriyoları topla. 2-4 dk için % 2 sistein (pH 8.0) ile hafifçe yıkanarak dejelly. Embriyoları 0,1x Mark’ın Modifiye Ringer çözeltisi (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2,5 mM HEPES, pH 7.4-7.6’ya ayarlanmış olarak durulayın. Embriyoları 0.1x MMR ve 50 μg/mL gentamisin içeren 100 mm cam Petri kaplarına aktarın. Plaka başına 50-100 embriyo yoğunluğu uygundur. 14 °C-22°C’de kuluçkaya yatve embriyoların istenilen gelişim evresine ulaşınceye kadar gelişmelerine izin verin. Periyodik olarak döllenmemiş hücreleri ve nekrotik veya anormal bir plastik transfer pipet ile embriyolar gelişmekte kaldırmak.NOT: Tutarlılık sağlamak için Nieuwkoop ve Faber16tarafından tanımlanan morfolojik kriterlere göre gelişimsel evreleme yapılmaktadır. İlgi aşamaları deneysel odaklamaya bağlı olarak değişir. Örneğin, önemli nörogelişimsel yapılar Evre 14 (nörülasyon başlangıcı), Evre 18 (nöral tüp kapatma başlangıcı) ve Evre 22 (tailbud uzaması başlangıcı) ile ilişkilidir. 2. Embriyo Diseksiyon ve Örnek Hazırlama Çözüm hazırlama 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1,31 mM MgSO4ve 4,6 mM Tris içeren 2 mM Ca2+ çözelti hazırlayın. Her 100 mL çözelti için 1 mL penisilin/streptomisin (10.000 U/mL penisilin; 10.000 μg/mL streptomisin) ekleyin. pH’ı 7.8’e ayarlayın ve filtresterilize edin. 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris ve 0,4 mM EDTA’yı birleştirerek kalsiyum ve magnezyumsuz (CMF) çözelti hazırlayın. Sterilize etmek için pH’ı 7.8’e ayarlayın ve otoklav. Her 100 mL çözelti için 1 mL penisilin/streptomisin (10.000 U/mL penisilin; 10.000 μg/mL streptomisin) ekleyin. pH’ı 7.8’e ayarlayın ve filtresterilize edin. Diseksiyon ve görüntüleme için plakaların hazırlanması UV-sterilize iki 35 mm plastik Petri yemekleri ve bir 35 mm Hücre Kültür Çanak (Malzeme Tablosubakınız). Laminar akış kaputunda çalışırken, her biri 10 mL 2 MM Ca2+ çözelti içeren iki adet 50 mL plastik konik tüp hazırlayın. Laminar akış kaputunda çalışmaya devam edin ve bir 35 mm plastik Petri kabına 2 mL 2 mM Ca2+ çözelti, bir adet 35 mm Hücre Kültürü Kabına 2 mL 2 mL Ca2+ çözelti ve 35 mm plastik Petri kabına 2 mL CMF çözelti ekleyin. Laminar akış kaputunun dışında, iki adet 100 mm plastik Petri kabı ve bir adet 35 mm plastik Petri kabını 0,1 x MMR ve gentamisin (50 μg/mL) doldurun. 60 mm plastik Petri kabını etanolle doldurun. Diseksiyondan hemen önce, Ca2+ çözeltisi içeren 50 mL tüpten birine 0,01 g Kollajenaz B ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve çözeltiyi 60 mm’lik taze plastik Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla, istenilen gelişim aşamasında embriyoları tanımlayın. Adım 2.2.4’te hazırlanan 0.1x MMR + gentamisin içeren 100 mm plakadan birine en az altı uygun embriyo aktarmak için steril transfer pipetkullanın. Bu tutma plakası olarak hizmet edecektir. Bir embriyoyu 0,1x MMR + gentamisin içeren ikinci 100 mm plakaya aktarmak için steril transfer pipetkullanın. Bu diseksiyon plakası olarak hizmet edecektir. Embriyoların hareket edecek kadar yaşlı olması (yaklaşık evre 23 veya daha büyük), her embriyoyu diseksiyondan önce , 0,1% 3-aminobenzoik asit etil ester içeren bir çanağa transfer ederek anestezi kelebeğin 0.1x MMR’de gentamisin (50 μg/mL) ile seyreltilir. Embriyo hareketsiz hale getirildikten sonra, 0.1x MMR içeren tabağa gentamisin (50 g/mL) ile geri aktarın ve diseksiyona devam edin. Dikkatle embriyo çevreleyen vitellin membran kaldırın. Bu en kolay membran kavramak için ince forceps bir çift kullanırken embriyo stabilize etmek için künt forceps bir çift kullanılarak yapılabilir. Vitellin membranını ayırmak için ince pratisyen etlerle dikkatlice çekin. Embriyonun dorsal ve ventral bölgelerini ayırmak için ince çerkesler kullanın. Bu ön-posterior ekseni boyunca embriyo ‘çimdik’ için çaksiler kullanılarak yapılabilir, yarısında kesme. Steril transfer pipeti ile dorsal kısmı adım 2.2.5’te hazırlanan kollajenaz çözeltisi ile 60 mm plakaya aktarın. Ventral kısmını atın. Dorsal eksplant Oda sıcaklığında 1-2 dakika kollajenaz çözeltisi içinde kuluçkaya izin verin. Yavaşça diseksiyon plakasına geri aktarın. Ektodermin varsayımsal nöral dokusundan kalan tüm endodermal ve mezodermal kontaminasyonu dikkatlice çıkararak diseksiyonu tamamlayın. Evre 22 veya daha büyük embriyolar için, nöral tüp de kaldırılmalı ve atılmalıdır.NOT: Diseksiyon sırasında gerekirse, 2.2.4 adımda hazırlanan etanollü çanak, çifenlerin temizlenmesi veya yeniden sterilize edilmesi için kullanılabilir. Diseksiyon tamamlandıktan sonra, ekstrüzyonu adım 2.2.3’te hazırlanan 35 mm’lik Ca2+ çözeltisine yavaşça aktarın. Dört ekstesi toplanana kadar 2.4-2.9 adımlarını tekrarlayın. Dört eksplabitkiyi de CMF solüsyonu içeren 35 mm plakaya aktarmak için bir P1000 mikropipet kullanın, ekstesiler ile hava-su arabirimi arasında herhangi bir temasından kaçınmaya özen. Yavaşça çanak girdap böylece tüm ekstenler plakanın ortasında küme. Ekstremiteler ayrıştırmak için oda sıcaklığında 1 saat kuluçka.NOT: Dissosiyasyonda yardımcı olmak için CMF çözeltisine %0.025-0.01 tripsin eklenebilir. Bu, eski embriyoların (Evre 22 ve daha büyük) verimli bir şekilde dissosiyanasyonu için gerekli olabilir. Bu noktada, en az iki uygun sahnelenmiş embriyolar tutma plaka üzerinde kalmalıdır. Adım 2.2.4 hazırlanan gentamisin ile 0.1x MMR ile dolu taze bir çanak bu embriyolar aktarın ve onları explant çanak maç için kaplı çanak ile bozulmamış geliştirmek için izin. Bu embriyolar kardeş kontrolleri olarak hizmet verecek. Adım 2.2.3’te hazırlanan 35 mm Hücre Kültürü Çanağı’nın altına mikro kurallı bir kapak kayması (Bkz. Malzeme Tablosu)takmak için süper yapıştırıcı kullanın.NOT: Kapak kapağının kenarlarına küçük yapıştırıcılar yerleştirin, ardından Hücre Kültürü Çanağı’nın alt tarafına sıkıca bastırın. Konumsal işaretler tutkal ızgara ile temas ettiği her yerde gizlenecektir, bu nedenle kapağın merkezi ızgaralı kısmının yapışkandan uzak tutulması önemlidir. Ekstesiler 1 saat için ayrıldıktan sonra, Hücre Kültür Çanağı’na aktarmak için p100 mikropipet kullanın. Yemeğin ızgaralı kısmına mümkün olduğunca çok hücre yitirmek için, pipeti kabın yüzeyine yakın sığ bir açıda tutun, pipet ucunu ızgaranın köşesine içe bakacak şekilde yerleştirin ve hücre süspansiyonunu ızgaralı ar boyunca sıkıca dışarı atlayın ea. İdeal olarak, hücreler sıkı bir yoğun kümeye yerleşir. Hücrelerin tabağa yapışmasını sağlamak için oda sıcaklığında 1 saat kuluçka. Bu kuluçka başladığında kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini belirleyin ve kaydedin. 5 μL 1 mM Fluo-4 ‘yi (bkz. Malzeme Tablosu)2 μL Pluronik F-127 asitle birleştirin.NOT: Fluo-4 ışığa duyarlıdır ve her zaman ışık la ilgili veya folyo kaplı bir tüpte tutulmalıdır. Kuluçka tamamlandıktan sonra, örnek tabağı karanlık bir odaya veya ışığa karşı korumalı başka bir konuma taşıyın. Yemeğin kenarından 100 μL çözeltiyi çıkarmak için bir mikropipet kullanın. Fluo-4 AM/Pluronic F-127 asit, pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için aliquot bu çözeltiyi ekleyin ve örnek çanak tam hacmi dönmek. Karıştırmak için yavaşça girdap. Alüminyum folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçka ya da izin verin. Bu kuluçka başladığında kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini belirleyin ve kaydedin. Kuluçka sonunda, 2 mM Ca2+ kalan konik tüpü kullanarak aşağıdaki şekilde üç adet ortam yıkama sıcağı sıcağı sıcağı sıcayın 1 mL’sini çıkarın, 3 mL taze çözelti ekleyin, 2) 3 mL çözeltiyi yemekten çıkarın, 3 mL taze çözelti ekleyin, 3) 3 mL çözeltiyi yemekten çıkarın, 3 mL taze çözelti ekleyin. 3. Kalsiyum Görüntüleme NOT: Kalsiyum görüntüleme ters konfokal mikroskop(Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirildi. Numune plakasını mikroskop aşamasına yerleştirin ve ortam ışığına maruz kalmasına karşı korumaya özen duyun. Plaka sabitlendikten sonra, aynı görüş alanının sonraki görüntülemede bulunabilmesi için plakanın ön noktasını etiketlemek için bir işaretçi kullanın. Örneği mikroskop altında (önce 10X’ te, sonra 20X büyütmede) bulun ve görüntüleme için uygun bir görüş alanı seçin. İdeal bir görüş alanı hücre yoğundur, ancak hücrelerin kümelenmiş veya ayrı ayrı ayırt edilmesi zor olacak kadar yoğun değildir. Mikroskop odağı, ızgara yönetimindeki kapak kaymasının görünür olması için ayarlayın. Kapak ta işaretli sayılar, belirli ızgara lokusu için benzersiz tanımlayıcılar olarak hizmet vermektedir ve ek görüntüleme için aynı görüş alanını bulmak için kullanılabilir. Başlangıçta seçili görünüm alanı herhangi bir sayıyla çakışmıyorsa, tanımlanabilir bir sayı çerçevede olana kadar yeniden gözden kalım. Odakta ızgara kurallı kapak kayma ile seçilen görüş alanının parlak alan görüntüsünü alın. Odak ayarlarını ayarlayın ve seçili görüş alanının parlak alan görüntüsünü odaktaki hücrelerle alın. Odak hücre tabakası ile, 488 nm lazer ile örnekleri aydınlatmak. FITC kanalında dinamik bir floresan aralığıalgıldığından emin olmak için her deneme için HV ve Ofset değerleri optimize edilebilir. İki saatlik görüntü için, görüntü elde etmek için 3,93 s’lik bir taramayı ve 8 s. Çalıştır yapılandırmasına sahip 901 kareyi kaydacak şekilde görüntüleme yapılandırmasını değiştirin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, plakayı mikroskop aşamasından çıkarın. 1 mL çözeltiyi plakadan çıkarın ve 1 mL 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA ve 2 mM MgSO4% 7.4 formaldehit) ile değiştirin. Plakayı oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C’de 2 saat kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka başladığında kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini belirleyin ve kaydedin. Fiksasyon tamamlandıktan sonra, plakadaki tüm çözeltiyi çıkarın ve 2 mL 1x PBS ile değiştirin. Daha fazla işleme için plakaları 4 °C’de saklayın. 4. Gen Ekspresyonu Analizi: Prob Sentezi Aşağıda açıklandığı gibi, in situ hibridizasyon için bir antisense RNA prob oluşturmak. Ayrıca, negatif kontrol olarak kullanılmak üzere aynı gen için bir duyu prob oluşturmak. Prob şablon dizisini içeren plazmid DNA’sını arındırmak için, 150 mL LB suyu ile şablon plazmid içeren bakteriyel gliserol stokları ile aşılanın. 37 °C’de bir gecede veya kültür bulanık olana kadar sallayarak kuluçkaya yatırın. Seçtiğiniz yöntemi kullanarak bakteri kültüründen plazmid DNA arındırın.NOT: Biz plazmid DNA yüksek verim elde etmek için McNary-Nagel midi-hazırlık kiti kullanın. Plazmid beklenen eklemek içerdiğini doğrulamak için, bir kısıtlama sindirmek gerçekleştirmek ve bir agarose jel üzerinde ürünleri analiz. Kesilmemiş plazmid de genomik DNA kontaminasyonu kontrol etmek için bir agarose jel üzerinde analiz edilebilir. Şablon DNA’sını doğrusallaştırmak için, 20 g plazmid DNA, 2 μL uygun restriksiyon enzimi ve 1 x uygun tampon içeren 100 μL’lik bir sindirimi reaksiyonu ayarlayın. En az 2 saat boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Bir fenol /kloroform ekstraksiyonu ve ardından kloroform ekstraksiyonu yaparak doğrusallaştırılmış DNA ayıklayın. 0 etanol ile DNA’yı çökeltin. Bu, numuneye iki hacim soğuk etanol eklenerek ve katılanıncaya kadar -80 °C’de kuluçkaya yatırılarak hızlı bir şekilde yapılabilir (15-30 dk). 12.000 x g/4 °C’de 20 dakika eğilerek DNA’yı peletlemek için soğutulmuş bir santrifüj kullanın. Supernatant çıkarın ve% 70 etanol 200 μL ile pelet yıkayın. 12.000 x g/4 °C’de 5 dk spin. Supernatant ve hava-kuru pelet için yaklaşık 5 dakika çıkarın. 20 μL 1x TE resuspend ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C’de saklayın. Antisense RNA probu sentezlemek ve arındırmak için 10 mM rCTP’nin 15 μL’si, 10 mM rGTP’nin 15 μL’si, 10 mM rATP’nin 15 0mL’si, 10 mM rUTP’nin 9,75 555 μL’si ve 5,25mL 10 mM dig-11 Malzeme (UTP’nin)5,25m L’lik bir karışımını birleştirerek 2,5 mM rNTP karışımı oluşturun. Adım 4.2-4.10’dan 4 μg doğrusallaştırılmış şablon DNA içeren 50 μL in vitro transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın, Adım 4.11’den 2,5 mM rNTP karışımının 15’i, 5x transkripsiyon tamponunun 10’u, 0,1 M DTT’nin 5 0,5 l’si, 0,5 μL RNa inhibitörü (20 U/μL) ve 1,5 μL uygun RNA polimeraz (T3, T7 veya SP6). 37 °C’de kuluçka 1 saat. Reaksiyona 1,5°L rNA polimeraz ekleyin ve bir saat ek olarak 37 °C’ye geri dönün. Reaksiyona 1 μL RQ1 DNae ekleyin ve DNA şablonunu düşürmek için 10 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Numuneye 30 μL 7,5 M LiCl çözeltisi ekleyin. Pipet en az 1 saat boyunca -20 °C’de karıştırıp kuluçkaya yatırın. Soğutulmuş bir santrifüj kullanarak, numuneyi 14.000 x g/4 °C’de 25 dk çevirin. Supernatant çıkarın ve% 70 etanol 500 μL ile pelet durun. 14.000 x g/4 °C’de 5 dk spin. Yaklaşık 5 dk. Nükleaz içermeyen su 20 μL resuspend için supernatant ve hava-kuru pelet çıkarın. Hibridizasyon Tamponunda numuneyi 10 ng/μL konsantrasyona seyrelterek 10x prob stoku oluşturun ( formamid, 5x SSC (tuzlu-sodyum sitrat; 750 mM NaCl, 75 mM sodyum sitrat, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, %0.1 Ara-20, 1x Denhardt’ın Solüsyonu, %0.1 CHAPS, 10 mM EDTA ve 100 μg/mL heparin). Daha fazla kullanım alakadar -20 °C’de saklayın. 5. Gen Ekspresyonu Analizi: Floresan In Situ Hibridizasyon NOT: Tüm yıkarlar steril, ayrı ayrı sarılmış transfer pipeti kullanılarak yaklaşık 1 mL çözelti ile yapılmalıdır. Pipet çıkarKen veya çözelti eklerken plakanın kenarına yerleştirilmeli ve hücrelerin plaka yüzeyinden çıkarılmaması ve kaybolması için yıkarlar mümkün olduğunca nazikçe yapılmalıdır. 1x PBS’yi plakadan çıkarın (adım 3.10’dan). Taze 1x PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka. 25 mL 0,1 M trietanolamine (pH 8.0) ile 62.5 μL asetik anhidriti birleştirin. İyi bir şekilde karıştırın. 10 dk bu çözelti ile plakayı yıkayın. 5 dakika boyunca 1x SSC ile plakayı yıkayın. Hücreleri permeabilize etmek için 10 dakika boyunca 0,02 M HCl ile plakayı yıkayın. Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile 2x yıkayın. Çözeltiyi çıkarın ve 1 mL Hibridizasyon Tamponu ekleyin ( formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM sodyum sitrat, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, %0.1 Ara-20, 1x Denhardt’s Solution, %0.1 CHAPS, 10 mM EDTA ve 100 μg/mL heparin) plakaya. 60 °C’de en az 6 saat sallayarak inküble. Hibridizasyon Tamponunu çıkarın ve 750 μL 1x RNA Probu çözeltisi (seyreltilmiş form 10x stok adım 4.19 yapılan değiştirin. Sense RNA probları negatif kontrol olarak kullanılabilir. 60 °C’de 8-14 saat sallayarak inküböz. Probu çıkarın ve -20 °C’de saklayın.NOT: 1x probu seyreltme atılmadan önce üç kez kadar yeniden kullanılabilir. Plakayı 0.2x SSC ile durulayın. 60 °C’de 1 saat boyunca taze 0,2x SSC ile yıkayın. Plakaları oda sıcaklığına taşıyın ve 5 dakika boyunca dengeleyin. Plakayı 0,2x SSC ile 5 dakika yıkayın. 15 dakika boyunca 1x PBT ile plakayı yıkayın. 1 saat boyunca 1x PBT’de %2 H2O2 (%0,1 Triton-x-100) ile plakayı yıkayın.NOT: Bu çözelti ışığa duyarlıdır, bu nedenle her deney için taze yapılmalı ve ışıktan korunmalıdır. Plakalar da ışıktan korunmalıdır veya bu kuluçka sırasında engellenmelidir. 15 dakika boyunca 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1%Tween-20) ile plakayı yıkayın. Maleik Asit Tamponda %2’ye Kadar Seyreltik Bloke Reaktif (100 mM maleik asit, 150 mM NaCl, pH 7.5). Oda sıcaklığında en az 1 saat için bu karışımdaki hücreleri engelleyin. Bloke çözeltisini , Maleik Asit Tamponunda %2 Blokajlı Reaktifte seyreltilmiş 1:1.000 anti-digoksijenin-POD antikorile değiştirin. Gece boyunca 4 °C’de kuluçkaya yatırın. 1x TBST ile plaka 3x durulayın. Yıkama başına en az 15 dakika boyunca sürekli sallanan 1x TBST 2mL ile 4x yıkayın. 2x 1x PBT ile yıkama başına en az 10 dakika boyunca sürekli sallanan. Seyreltik Cy3-konjuge tyramide 1:25 1x PBT içinde. 5 dakika boyunca bu seyreltme 750 μL ile plakayı yıkayın.NOT: Bu çözelti son derece ışığa duyarlıdır ve sinyal bozulmasını önlemek için plakalar deneyin geri kalanında engellenmeli veya ışıktan korunmalıdır. Bu çözeltiye %0,3 H2O2’lik 2,5 00 000 000’lik bir ek katila ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca sürekli sallanma ile inkübed. Yıkama başına en az 15 dakika boyunca 1x TBST ile 4x yıkayın sürekli sallanan. 1x PBT ile durula. Hücreleri 1x MEMFA’da (100 mM MOPS, 1 mM EGTA ve 1 mM MgSO4% 3.7 formaldehit) oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi çıkarın ve 1x PBS ile değiştirin. Plakaları 4 °C’de folyolu bir kapta, daha fazla işleme konana kadar saklayın. 6. Görüntüleme Hücreleri NOT: Görüntüleme ters konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Örnek plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve adım 3.1’de yapılan işareti sahnenin önüne hizalayın. Görüntüyü ızgara kaplı kapak kaymasının görünür olması için odaklayın ve 3.4. Hem ızgaranın hem de hücrelerin parlak alan görüntülerini edinin. Örnekleri 595 nm TRITC lazerile aydınlatın. Negatif kontrol hücrelerinden görüntüleri kullanarak sinyali arka plandan uygun şekilde ayırt etmek ve hareketsiz bir görüntü elde etmek için kazanç değerlerini ayarlayın.NOT: İdeal olarak, arka plan floresan düzeyleri, hedeflemeyen bir duyu RNA probuile paralel olarak işlenen negatif kontrol plakası esas alınarak belirlenir. Kazanç ayarları, bu plakanın tamamen siyah görünmesi (arka plan seviyelerine karşılık gelen) şekilde ayarlanır ve daha sonra bu deneysel toplu işlemden görüntülenen diğer plakalar için sabit tutulur. 7. Veri İşleme NOT: Veri işleme Nikon Elements yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Adım 3.7 2 saat kalsiyum görüntü açın. İkili > Nokta Algılama > Parlak Noktalar’ı seçerek her bir hücreye karşılık gelen pikselleri tanımlayın. FITC kanalının seçildiğinden emin olun. Bu katman oluşturulduktan sonra tek tek hücrelerin üzerinde renkli daireler görünür. Hücre dağıtımını ve boyut parametrelerini, mümkün olduğunca çok hücrenin tanınması ve benzersiz bir tanımlayıcıyla ilişkilendirilmeleri için ayarlayın. Görüntü > Çözümleme Denetimleri > İzleme Seçenekleri’ne yönlendirerek görüntünün tüm karelerinde hücreleri izleyin. Parçalar arasındaki en büyük boşluk olarak 5 kare ayarlayın, 600’den az kareyle ilişkili nesneleri silin ve Boşlukları Kapat seçeneğini belirleyin. Görüntüye hücre izlemeyi uygulamak için İkili Leri Takip Et’i seçin. Hücreler izlendikten sonra, tek bir hücreye karşılık gelen nesneleri el ile silin (örneğin bir hücre yığını). Ancak, kalsiyum aktivitesi izmorfolojisi dayalı veri noktaları daha fazla analiz dışında tutulamaz. Resim bölmesinde, Yer Kaplamasını Görüntüle > İkili Nesne Kimliğini Göster’iseçin. Görüntünün sonuna gidin (Frame 901) ve Edit > Create View Snapshot (8bit RGB)> Geçerli Çerçeve > Tamam’ıseçin. Bu, her hücrenin ilişkili ikili kimliği görünür olan görüntünün son çerçevesinin anlık görüntüsünü oluşturur. Bu görüntüyü kaydedin. Zaman serisi verilerini excel’e veri aktarıncaizlenen tüm nesneleri seçerek dışa aktarma. Çıktıyı CSV dosyası olarak kaydedin. FISH görüntüsünü açın. FITC kanalı yerine TRITC kanalını kullanarak 7.1-7.2 adımlarında olduğu gibi nokta algılamayı optimize edin. Yanlış atanan ikili leri el ile silin, ardından her hücrenin sinyal yoğunluğunu hesaplamak için Otomatik Ölçüm Sonuçları > Güncelleştirme Ölçümü’nü seçin. 7.5 ve 7.6 adımlarını yineleyerek görüntü anlık görüntü ve veri tablosunu dışa aktarın. A sütununun FISH İkili Kimliği ve B sütununun Kalsiyum İkili Kimliğiolarak etiketlendiği bir elektronik tablo oluşturun. 7.5 ve 7.7 adımlarında dışa aktarılan görüntüleri açın. FISH görüntüsünde tanımlanan her nesne için (adım 7.7), ikili kimliği A sütununa kaydedin. Daha sonra, ilgili hücreyi kalsiyum görüntüsünde bulun (adım 7.5) ve B sütunundaki ikili kimliği kaydedin.NOT: Her iki görüntüyü de açmak, bir yarı saydam yapmak ve her hücreyle ilişkili iki ikili kimliği daha kolay tanımlamak ve bağlamak için iş ortağı resmine bindirmek için Adobe Photoshop veya GIMP görüntü düzenleyicisi gibi bir fotoğraf düzenleme programı kullanmak yararlı olabilir. Tanımlanan her hücre için, harmanlama (el ile veya komut dosyası ile) zaman serisi kalsiyum verileri (Kalsiyum İkili Kimliği ile ilişkili ve adım 7.6’da dışa aktarılan) ve gen ifade verileri (FISH İkili Kimliği ile ilişkili ve adım 7.7’de dışa aktarılan).NOT: Downstream veri işleme ve analizi tek bir veri tablosu nda bu verileri harmanlama ve ani sayma, fraktal analiz ve araştırmacı kalsiyum aktivitesi 17,18yeni desenler ayırt etmek için izin Markovian entropi de dahil olmak üzere analitik teknikler bir dizi uygulayarak içerebilir.