Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Tous les travaux impliquant des animaux ont été exécutés conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Collège De William et Mary. 1. Soins aux animaux et manipulation d’embryons Induire l’accouplement naturel en administrant une injection sous-cutanée de gonadotropine chorionique humaine (HCG) dans le sac lymphatique dorsal de Xenopus laevis adulte à une dose de 600 U pour les femelles et 400 U pour les mâles. Après l’injection, placez au moins un mâle et une grenouille femelle dans un réservoir de retenue à température ambiante pendant la nuit. La ponte commence généralement de 9 à 12 h après l’administration de HCG. Recueillir des embryons. Dégelée en lavant doucement avec 2% de cystéine (pH 8.0) pendant 2-4 min. Rincer les embryons 3x dans la solution de 0.1x Mark’s Modified Ringer (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH ajusté à 7,4 à 7,6). Transférer les embryons dans des boîtes Petri en verre de 100 mm contenant 0,1 x MMR et 50 g/mL de gentamycine. Une densité de 50-100 embryons par plaque est appropriée. Incuber les plats à 14 oC et 22 oC et permettre aux embryons de se développer jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité. Enlevez périodiquement les cellules non fertilisées et les embryons nécrotiques ou anormalement en développement avec une pipette de transfert en plastique.REMARQUE : Pour assurer la cohérence, la mise en scène du développement est réalisée selon des critères morphologiques définis par Nieuwkoop et Faber16. Les stades d’intérêt varieront en fonction de l’accent expérimental. Par exemple, les principaux repères neurodéveloppementaux sont associés à l’étape 14 (début de la neurulation), à l’étape 18 (début de la fermeture du tube neural) et à l’étape 22 (début de l’allongement du tailbud). 2. Dissection d’embryon et préparation d’échantillon Préparation de la solution Préparer une solution de 2 mM Ca2M contenant 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2x 2H2O, 1,31 mM MgSO4et 4,6 mM Tris. Pour chaque solution de 100 ml, ajouter 1 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline; 10 000 g/mL de streptomycine). Ajuster le pH à 7,8 et filtrer-stériliser. Préparer une solution sans calcium et magnésium (CMF) en combinant 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris et 0,4 mM EDTA. Ajuster le pH à 7,8 et l’autoclave pour stériliser. Pour chaque solution de 100 ml, ajouter 1 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline; 10 000 g/mL de streptomycine). Ajuster le pH à 7,8 et filtrer-stériliser. Préparation des plaques pour la dissection et l’imagerie Stérilisez les UV deux boîtes Petri en plastique de 35 mm et un plat de culture cellulaire de 35 mm (voir Tableau des matériaux). Tout en travaillant dans une hotte à débit laminaire, préparer deux tubes coniques en plastique de 50 ml contenant 10 ml de solution De 2 mM Ca2 chacun. Restez en état de travailler dans le capot à débit laminaire et ajoutez 2 ml de solution Ca2 à un plat Petri en plastique de 35 mm, 2 ml de solution Ca2 à un plat de culture cellulaire de 35 mm et 2 mL de solution CMF à un plat Petri en plastique de 35 mm. À l’extérieur du capot à débit laminaire, remplissez deux boîtes Petri en plastique de 100 mm et un plat Petri en plastique de 35 mm avec 0,1 x MMR avec de la gentamycine (50 g/mL). Remplir un plat Petri en plastique de 60 mm avec 70 % d’éthanol. Immédiatement avant la dissection, ajouter 0,01 g de Collagène B à l’un des tubes de 50 ml contenant la solution Ca2. Bien mélanger et transférer la solution dans un plat Petri en plastique frais de 60 mm. À l’aide d’un microscope disséquant, identifiez les embryons du stade de développement souhaité. Utilisez une pipette de transfert stérile pour transférer au moins six embryons appropriés dans l’une des plaques de 100 mm contenant 0,1x ROR et la gentamycine préparées à l’étape 2.2.4. Cela servira de plaque de retenue. Utilisez une pipette de transfert stérile pour transférer un embryon dans la deuxième plaque de 100 mm contenant 0,1x ROR et la gentamycine. Cela servira de plaque de dissection. Si vous disséquez des embryons assez âgés pour se déplacer (environ 23 ou plus), anesthésiez chaque embryon avant la dissection en le transférant dans un plat contenant 0,1 % d’estreur éthylique acide 3-aminobenzoïque dilué en 0,1x MMR avec de la gentamycine (50 g/mL). Une fois l’embryon immobilisé, transférez-le dans le plat contenant 0,1x ROR avec de la gentamycine (50 g/mL) et continuez avec la dissection. Retirez soigneusement la membrane vitelline qui entoure l’embryon. Cela peut plus facilement être fait en utilisant une paire de forceps émoussés pour stabiliser l’embryon tout en utilisant une paire de forceps fins pour saisir la membrane. Tirez soigneusement avec les fines forceps pour éplucher la membrane vitelline. Utilisez des forceps fins pour séparer les régions dorsal et ventrale de l’embryon. Cela peut être fait en utilisant les forceps pour «pincer» l’embryon le long de l’axe antérieur-postérieur, le coupant en deux. À l’avance d’une pipette de transfert stérile, transférer la partie dorsal sur la plaque de 60 mm avec une solution de collagène préparée à l’étape 2.2.5. Jeter la partie ventrale. Laisser l’explante dorsal incuber dans la solution de collagène pendant 1 h 2 à température ambiante. Revenez délicatement sur la plaque de dissection. Terminer la dissection en enlevant soigneusement toute contamination endodermale et mésodermale résiduelle du tissu neural présumé de l’ectoderm. Pour les embryons à l’étape 22 ou plus, le tube neural doit également être enlevé et jeté.REMARQUE : Si nécessaire pendant la dissection, le plat de 70 % d’éthanol préparé à l’étape 2.2.4 peut être utilisé pour effacer ou re-stériliser les forceps. Une fois la dissection terminée, transférer délicatement l’explante sur la plaque de 35 mm de la solution Ca2MD préparée à l’étape 2.2.3. Répétez les étapes 2.4-2.9 jusqu’à ce que quatre explants aient été collectés. Utilisez une micropipette P1000 pour transférer les quatre explants sur la plaque de 35 mm contenant la solution CMF, en prenant soin d’éviter tout contact entre les explants et l’interface air-eau. Faites tourbillonner doucement le plat de sorte que toutes les explantations se regroupent au centre de l’assiette. Incuber 1 h à température ambiante pour permettre aux explants de se dissocier.REMARQUE : Pour faciliter la dissociation, la trypsine de 0,025 % à 0,01 % peut être ajoutée à la solution CMF. Cela peut être nécessaire pour une dissociation efficace des embryons plus âgés (stade 22 et plus). À ce stade, au moins deux embryons correctement mis en scène devraient rester sur la plaque de retenue. Transférer ces embryons dans un plat frais rempli de 0,1x ROR avec de la gentamycine préparée à l’étape 2.2.4 et leur permettre de se développer sans être dérangéavec le plat couvert pour correspondre au plat d’explantation. Ces embryons serviront de contrôle des frères et sœurs. Utilisez la superglue pour attacher un bordereau micro-gouverné (voir Tableau des matériaux) au fond du plat de culture cellulaire de 35 mm préparé à l’étape 2.2.3.REMARQUE : Placez de petites touches de superglue sur les bords de la couverture, puis appuyez fermement contre le dessous du plat de culture cellulaire. Les marques positionnelles seront masquées partout où la colle entre en contact avec la grille, il est donc important de garder la partie centrale quadrillée de la couverture libre de l’adhésif. Une fois que les explants se sont dissociés pendant 1 h, utilisez une micropipette P100 pour les transférer au plat de culture cellulaire. Afin de plaquer autant de cellules que possible sur la partie quadrillée du plat, maintenez la pipette à un angle peu profond près de la surface du plat, placez la pointe de pipette dans le coin de la grille faisant face vers l’intérieur, et expulsez fermement la suspension de cellule à travers l’ar quadrillé ea. Idéalement, les cellules s’installeront dans un amas dense serré. Incuber pendant 1 h à température ambiante pour permettre aux cellules d’adhérer à la plaque. Déterminer et enregistrer le stade de développement des embryons témoins par les frères et sœurs lorsque cette incubation commence. Combiner 5 L 1 mM Fluo-4 AM (voir Tableau des matériaux) avec 2 l l de 10 % d’acide Pluronic F-127.REMARQUE : Fluo-4 AM est sensible à la lumière et doit être conservé dans un tube léger ou recouvert de papier d’aluminium en tout temps. Une fois l’incubation terminée, déplacez l’échantillon de plat dans une chambre noire ou un autre endroit protégé par la lumière. Utilisez une micropipette pour enlever 100 l de solution du bord du plat. Ajoutez cette solution à l’aliquot de l’acide Fluo-4 AM/Pluronic F-127, pipette de haut en bas pour mélanger, et retournez le volume complet au plat d’échantillon. Tourbillonner doucement pour mélanger. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et laisser incuber pendant 1 h à température ambiante. Déterminer et enregistrer le stade de développement des embryons témoins par les frères et sœurs lorsque cette incubation commence. À la fin de l’incubation, utilisez le tube conique restant de 2 mM Ca2 pour effectuer trois lavages de support de la manière suivante : 1) retirer 1 ml de solution du plat, ajouter 3 ml de solution fraîche, 2) retirer 3 ml de solution du plat, ajouter 3 ml de solution fraîche, 3) retirer 3 ml de solution du plat, ajouter 3 ml de solution fraîche. 3. Imagerie de calcium REMARQUE : L’imagerie calcique a été réalisée à l’aide d’un microscope confocal inversé(tableau des matériaux). Placez la plaque d’échantillon sur l’étape du microscope, en prenant soin de la protéger de l’exposition à la lumière ambiante. Une fois la plaque fixée, utilisez un marqueur pour étiqueter le point avant de la plaque afin que le même champ de vision puisse être trouvé dans l’imagerie ultérieure. Localisez l’échantillon au microscope — d’abord à 10X, puis à 20X grossissement — et sélectionnez un champ de vision approprié pour l’imagerie. Un champ de vision idéal est dense en cellules, mais pas si dense que les cellules sont agglomérées ou difficiles à distinguer individuellement. Ajuster la mise au point du microscope de sorte que la glissière de couverture à grille soit visible. Les nombres marqués sur la feuille de couverture servent d’identifiants uniques pour un locus de grille particulier et peuvent être utilisés pour localiser le même champ de vision pour une imagerie supplémentaire. Si le champ de vision initialement sélectionné ne se chevauche pas avec les nombres, réajuster jusqu’à ce qu’un nombre identifiable soit dans le cadre. Prenez une image lumineuse du champ de vision avec le bordereau de couverture à grille au point. Ajustez les réglages de mise au point et prenez une image de champ lumineux du champ de vision sélectionné avec les cellules au point. Avec la couche cellulaire en ligne, illuminez les échantillons avec un laser de 488 nm. Les valeurs HV et Offset peuvent être optimisées pour chaque expérience afin de s’assurer qu’une plage dynamique de fluorescence est détectée sur le canal FITC. Pour une image de deux heures, modifiez la configuration d’imagerie pour enregistrer 901 images avec un temps de balayage de 3,93 s et un intervalle de 8 s. Configuration de course pour acquérir l’image. Une fois l’imagerie terminée, retirez la plaque du stade du microscope. Retirer 1 ml de solution de la plaque et la remplacer par 1 ml de 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA, et 2 mM MgSO4 dans 7,4% de formaldéhyde). Incuber la plaque pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC. Déterminer et enregistrer le stade de développement des embryons témoins par les frères et sœurs lorsque cette incubation commence. Une fois la fixation terminée, retirer toute la solution de la plaque et la remplacer par 2 ml de 1x PBS. Conserver les assiettes à 4 oC pour un traitement ultérieur. 4. Analyse de l’expression génique : Synthèse de sonde Comme décrit ci-dessous, générer une sonde d’ARN antisens pour l’hybridation in situ. En outre, générer une sonde de sens pour le même gène pour une utilisation comme un contrôle négatif. Afin de purifier l’ADN plasmide contenant la séquence de modèle de sonde, inoculer 150 ml de bouillon LB avec des stocks bactériens de glycérol contenant le plasmide du modèle. Incuber à 37 oC en secouant pendant la nuit ou jusqu’à ce que la culture soit turbide. Purifiez l’ADN plasmide de la culture bactérienne en utilisant votre méthode de choix.REMARQUE : Nous utilisons le kit de préparation midi McNary-Nagel pour obtenir des rendements élevés d’ADN plasmide. Pour confirmer que le plasmide contient l’insert attendu, effectuer un digest de restriction et d’analyser les produits sur un gel d’agarose. Le plasmide non coupé peut également être analysé sur un gel d’agarose pour vérifier la contamination par l’ADN génomique. Pour linéariser l’ADN du modèle, configurez une réaction de digestion de restriction de 100 L contenant 20 g d’ADN plasmide, 2 l d’enzyme de restriction appropriée et 1x tampon approprié. Incuber à 37 oC pendant au moins 2 h. Extraire de l’ADN linéaire en effectuant une extraction de phénol/chloroforme suivie d’une extraction de chloroforme. Précipitez l’ADN avec 100% d’éthanol. Cela peut être fait rapidement en ajoutant deux volumes d’éthanol froid à l’échantillon et en l’incubant à -80 oC jusqu’à ce qu’il se solidifie (15-30 min). Utilisez une centrifugeuse réfrigérée pour granuler l’ADN en filant pendant 20 min à 12 000 x g/4 oC. Retirer le supernatant et laver la pastille avec 200 ll d’éthanol à 70%. Faire tourner pendant 5 min à 12 000 x g/4 oC. Retirer le supernatant et le granule à air sec pendant environ 5 min. Resuspendre dans 20 oL de 1x TE et conserver à 4 oC jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Pour synthétiser et purifier la sonde à ARN antisens, créez un mélange de 2,5 mM de rNTP en combinant 15 ml de 10 mL de rCTP, 15 l de 10 mM rGTP, 15 oL de 10 mL de rATP, 9,75 l de 10 ml de rUTP, et 5,25 oL de 10 mM de creusement-11 UTP (Voir tableau des matériaux). Mettre en place une réaction de transcription in vitro de 50 L contenant 4 g d’ADN de modèle linéaire à partir de l’étape 4.2-4.10, 15 l de mélange rNTP de 2,5 mM à partir de l’étape 4,11, 10 l de tampon de transcription 5x, 5 l de 0,1 M DTT, 0,5 oL d’inhibiteur de la RNAse (20 U/L) et 1,5 l de polymérase d’ARN appropriée (T3, T7 ou SP6). Incuber 1 h à 37 oC. Ajouter 1,5 l de polymérase d’ARN supplémentaire à la réaction et revenir à 37 oC pendant une heure supplémentaire. Ajouter 1 An1 RQ1 DNAse à la réaction et incuber à 37 oC pendant 10 min pour dégrader le modèle d’ADN. Ajouter 30 L de 7,5 M de solution LiCl à l’échantillon. Pipette à mélanger et à incuber à -20 oC pendant au moins 1 h. À l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée, faire tourner l’échantillon 25 min à 14 000 x g/4 oC. Retirer le supernatant et rincer le granule avec 500 ll d’éthanol à 70%. Faire tourner pendant 5 min à 14 000 x g/4 oC. Retirer le supernatant et le granule à air sec pendant environ 5 min. Resuspendre dans 20 l d’eau exempte de nucléane. Créer à 10x stock de sondes en diluant l’échantillon à une concentration de 10 ng/L dans hybridation Buffer (50% formamide, 5x SSC (citrate saline-sodium; 750 mM NaCl, 75 mM de citrate de sodium, pH 7,0), 1 mg/mL d’ARN torula, 0,1 % Tween-20, 1x Solution de Denhardt, 0,1 % CHAPS, 10 mM EDTA et 100 oG/mL heparin). Conserver à -20 oC jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. 5. Analyse de l’expression génique : Fluorescence in Situ Hybridization REMARQUE : Tous les lavages doivent être exécutés avec environ 1 ml de solution à l’aide d’une pipette stérile et emballée individuellement. La pipette doit être placée au bord de la plaque lors de l’enlèvement ou de l’ajout de la solution, et les lavages doivent être effectués aussi doucement que possible pour s’assurer que les cellules ne sont pas délogées de la surface de la plaque et perdues. Retirer 1x PBS de la plaque (à partir de l’étape 3.10). Remplacer par du PBS frais 1x et incuber 5 min à température ambiante. Combiner 25 mL de 0,1 M de triéthanolamine (pH 8,0) avec 62,5 l d’anhydride acétique. Bien mélanger. Laver l’assiette avec cette solution pendant 10 min. Laver l’assiette avec 1x SSC pendant 5 min. Laver la plaque avec 0,02 M HCl pendant 10 min pour perméabilize cellules. Laver 2x avec 1x PBS pendant 5 min chacun. Retirez la solution et ajoutez 1 ml de tampon d’hybridation (50% formamide, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM de citrate de sodium, pH 7,0), 1 mg/mL d’ARN torula, 0,1 % Tween-20, 1x Solution de Denhardt, 0,1 % CHAPS, 10 mM EDTA et 100 og/mL d’héparine) à l’assiette. Incuber en secouant pendant au moins 6 h à 60 oC. Supprimer le tampon d’hybridation et remplacer par une solution de sonde à ARN de 750 l l de 1x (sous forme diluée du stock 10x effectué à l’étape 4.19. Les sondes d’ARN de sens peuvent être employées comme contrôle négatif. Incuber en secouant pendant 8-14 h à 60 oC. Retirez la sonde et entreposez-la à -20 oC.REMARQUE : La dilution de la sonde 1x peut être réutilisée jusqu’à trois fois avant d’être jetée. Rincer la plaque avec 0.2x SSC. Laver avec du SSC frais de 0,2x pendant 1 h à 60 oC. Déplacer les assiettes à température ambiante et réquilibrer pendant 5 min. Laver l’assiette avec 0,2 x SSC pendant 5 min. Laver l’assiette avec 1x PBT pendant 15 min. Laver la plaque avec 2% H2O2 en 1x PBT (0.1% Triton-x-100) pendant 1 h.REMARQUE : Cette solution est sensible à la lumière, de sorte qu’elle doit être fraîche pour chaque expérience et protégée de la lumière. Les plaques doivent également être protégées de la lumière ou déjouées pendant cette incubation. Laver l’assiette avec 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) pendant 15 min. Diluer le réactif de blocage à 2% dans le tampon d’acide mâle (100 mM acide mâle, 150 mM NaCl, pH 7.5). Bloquer les cellules de ce mélange pendant au moins 1 h à température ambiante. Remplacer la solution de blocage par un anticorps anti-digoxygéné-POD dilué 1:1,000 dans 2% de réagent de blocage dans le tampon d’acide mâle. Incuber toute la nuit à 4 oC. Rincer la plaque 3x avec 1x TBST. Laver 4x avec 2mL de 1x TBST pendant au moins 15 min par lavage avec bascule continue. Laver 2x avec 1x PBT pendant au moins 10 min par lavage avec bascule continue. Diluer Cy3-conjugué tyramide 1:25 en 1x PBT. Laver l’assiette avec 750 l de cette dilution pendant 5 min.REMARQUE : Cette solution est extrêmement sensible à la lumière, et les plaques doivent être déjouées ou protégées de la lumière pour le reste de l’expérience afin d’éviter la détérioration du signal. Ajouter 2,5 ‘L de 0.3% H2O2 à cette solution et couver avec le basculement continu pendant 40 min supplémentaires à température ambiante. Laver 4x avec 1x TBST pendant au moins 15 min par lavage avec bascule continue. Rincer avec 1x PBT. Fixer les cellules en couve pendant 1 h à température ambiante dans 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA, et 1 mM MgSO4 dans 3,7% de formaldéhyde). Retirez la solution et remplacez-la par 1x PBS. Conserver les assiettes dans un contenant déjoué à 4 oC jusqu’à ce qu’elles soient traitées. 6. Cellules d’imagerie REMARQUE : L’imagerie a été exécutée utilisant un microscope confocal inversé. Placez la plaque d’échantillon sur la scène du microscope, en alignant la marque faite à l’étape 3.1 à l’avant de la scène. Concentrez l’image de manière à ce que la glissière doublée par grille soit visible et, à l’aide de l’image de grille prise à l’étape 3.4 comme référence, ajustez le champ de vision pour correspondre au champ de vision capturé dans l’image calcium (section 3). Acquérir des images lumineuses de la grille et des cellules. Illuminez les échantillons à l”infini d’un laser TRITC de 595 nm. Ajustez les valeurs de gain pour distinguer convenablement le signal de l’arrière-plan en utilisant les images des cellules témoins négatives et acquerdez une image fixe.REMARQUE : Idéalement, les niveaux de fluorescence de fond sont déterminés en fonction d’une plaque de contrôle négative traitée en parallèle avec une sonde d’ARN de sens non ciblage. Les réglages de gain sont ajustés de sorte que cette plaque semble complètement noire (correspondant aux niveaux de fond), puis maintenue constante pour d’autres plaques représentées à partir de ce lot expérimental. 7. Traitement des données REMARQUE : Le traitement des données a été effectué à l’aide du logiciel Nikon Elements. Ouvrez l’image de calcium de 2 h à partir de l’étape 3.7. Identifiez les pixels correspondant à chaque cellule individuelle en sélectionnant la détection binaire et la détection des tachesvives. Assurez-vous que le canal FITC est sélectionné. Des cercles colorés apparaîtront sur des cellules individuelles après que cette couche a été générée. Ajustez les paramètres de distribution et de taille des cellules afin que le plus grand nombre possible de cellules soient reconnues et associées à un identifiant unique. Suivre les cellules à travers toutes les images de l’image en naviguant à la vue de l’analyse contrôles ‘gt; Options de suivi. Définir 5 images comme l’écart maximal entre les pistes, supprimer les objets associés à moins de 600 images et sélectionner l’option Close Gaps. Sélectionnez les binaires de suivi pour appliquer le suivi cellulaire à l’image. Une fois les cellules suivies, supprimez manuellement tout objet qui ne correspond pas à une cellule individuelle (par exemple un amas de cellules). Cependant, les points de données ne devraient pas être exclus d’une analyse plus approfondie basée sur la morphologie de la trace d’activité calcique. Sur le volet image, sélectionnez Afficher la superpose -gt; Afficher l’ID d’objet binaire. Faites défiler jusqu’à la fin de l’image (Frame 901) et sélectionnez Edit ‘gt; Créer Afficher Snapshot (8bit RGB)’gt; Frame actuel ‘gt; OK. Cela créera un instantané de la dernière image de l’image avec l’ID binaire associé de chaque cellule visible. Enregistrer cette image. Exportez des données de la série chronologique en sélectionnant tous les objets suivis par Export Data vers Excel. Enregistrer la sortie en tant que fichier CSV. Ouvrez l’image FISH. Optimisez la détection des taches comme dans les étapes 7.1-7.2, en utilisant le canal TRITC au lieu du canal FITC. Supprimer manuellement tous les binaires mal attribués, puis sélectionnez les résultats de mesure automatisés pour calculer l’intensité du signal de chaque cellule. Exportez un instantané d’image et une table de données en répétant les étapes 7.5 et 7.6. Créez une feuille de calcul où la colonne A est étiquetée FISH Binary ID et la colonne B est étiquetée Calcium Binary ID. Ouvrez les images exportées dans les étapes 7.5 et 7.7. Pour chaque objet identifié dans l’image FISH (étape 7.7), enregistrez l’ID binaire dans la colonne A. Ensuite, localisez la cellule correspondante dans l’image calcium (étape 7.5) et enregistrez cet ID binaire dans la colonne B. Les cellules qui ne peuvent pas être identifiées en toute confiance dans les deux images ne doivent pas être ajoutées à la feuille de calcul.REMARQUE : Il peut être utile d’utiliser un programme de retouche photo comme Adobe Photoshop ou gIMP image editor pour ouvrir les deux images, en faire une semi-transparente et la reconssurer sur l’image de son partenaire afin d’identifier et de relier plus facilement les deux identifiants binaires associés à chaque cellule. Pour chaque cellule identifiée, rassemblez (manuellement ou avec un script) ses données de calcium de série temporelle (associées à l’ID binaire de calcium et exportées à l’étape 7.6) et ses données d’expression génique (associées à l’ID binaire FISH et exportées à l’étape 7.7).REMARQUE : Le traitement et l’analyse des données en aval peuvent impliquer la collecte de ces données dans une seule table de données et l’application d’un éventail de techniques analytiques, y compris le comptage des pointes, l’analyse fractale et l’entropie markovienne qui permettent à l’enquêteur de discerner de nouveaux modèles d’activité calcique 17,18.