Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Biyolojinin fenotipik kontrolünün başlıca iticileri oldukları için protein fonksiyonu ve stabilitesinin yakın düzenlenmesi son derece önemlidir. Bir proteinin işlevi iki bileşenden oluşturulur: içsel polipeptid dizisi ve herhangi bir posttranslational modifikasyon (PTM). Glikosilasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon¹dahil olmak üzere çeşitli kimyasal PTM’ler tanımlanmıştır. 1975’te Goldstein ve ark.² küçük bir protein tanımladı ve her yerde bulunan doğası nedeniyle her yerde olarak adlandırdı. Ubiquitin protein bozulmasında önemli bulunmuştur³. Bununla birlikte, o zamandan beri ubiquitin’in bir sinyal molekülü olarak işlevinin protein stabilitesinin düzenlenmesinin çok ötesine uzandığı tespit edilmiştir. Ubiquitin sinyali, protein stabilizasyonu, otofaji, hücre döngüsü kontrolü ve protein kaçakçılığı⁴gibi çok çeşitli diğer biyolojik işlevlerde yer almaktadır.

Diğer PTM’ler genellikle belirli bir site için ikili (yani protein modifiye edilir veya değiştirilmeden bırakılır) iken, ubiquitin bir proteini hem monomer hem de polimerik zincir olarak değiştirebilir ve ekli her yerde bulunur. Ayrıca, bu poliubiquitination zinciri, sekiz bağlantı sitesinden birine bağlı önceki ubiquitin’in her yerde bulunması ile çeşitli topolojilerde gelişebilir^5,6. Ubiquitin, ubiquitin’in C-terminusunun yedi lizin kalıntılarından birine bağlı olduğu çok çeşitli enzip enzymatic bir işlemle transfer edilir (K06, K11, K27, K29, K33, K48 veya K63) veya önceki her yerde bulunanın N terminali (M1 veya doğrusal her yerde bulunma olarak adlandırılır)^5,6. Bu zincir topolojisi, modifikasyonun altındaki proteinin kaderinin anahtarıdır. Örneğin, K48 veya K11 bağlantılı bir zincirle yapılan değişiklik, proteozomdaki değiştirilmiş proteinin bozulmasına yol açarken, NF-kB sinyalinin aktivasyonu için doğrusal bir zincir gereklidir. Bu nedenle, bu zincir topolojilerinin göreceli dağılımı çok çeşitli biyolojik sorularla ilgilidir.

Kütle spektrometresi (MS) kullanımı, antikor bazlı veya benzeşim tabanlı etkileşimlere dayanmadığı için her yerde zincir topoloji analizine özel bir fayda sağlar^7,8, birçoğu sınırlı özgüllüğe sahiptir ve çeşitli zincir türleri arasında ayrım yapmaz. Farklı bir algılama olasılığı genetiği değiştirilmiş her yerde mutantlar kullanmaktır. Burada, belirli bir lizin, ubiquitin tarafından modifikasyonu destekleyemeyen arginin ile değiştirilir. Substrat proteininde ubiquitin zinciri oluşumunun olmaması daha sonra belirli bir topoloji için kanıt olarak yorumlanır⁹.

Her yerde bulunan proteinlerin MS tabanlı tanımlanması, ubiquitin C-terminusunun, MS analizi için numunelerin proteolitik hazırlanması sırasında tripsin tarafından tanınan ve C-terminal çift glisini ayıran 74 pozisyonunda bir arginin kalıntısı içermesi gerçeğine dayanmaktadır. Bu GlyGly (-GG), substrat proteininin lizin kalıntısının ε-amino grubuna bağlı kalır. Ubiquitin topoloji analizi için, modifikasyon ubiquitin yedi lizin kalıntılarından birinde meydana gelir. Bu, topolojilerin her birine özgü, GG tarafından değiştirilen bir lizin kalıntısı taşıyan yedi anahtar peptit kümesi oluşturur (Şekil 2). Örneğin, K06 topolojisi ile, amino asit dizisindeki 6 pozisyonundaki lizin, bu lizine eklenen 114 Da’nın -GG modifikasyonu ile triptik sindirimden korunacaktır.

MS tarafından önceden belirlenmiş belirli peptitlerin tanımlanması, hedeflenen proteomik veya daha spesifik olarak hedeflenen peptit alımı¹⁰olarak adlandırılır. Kullanılan kütle spektrometresinin performansına bağlı olarak iki yöntem geliştirilmiştir. Bunlar, çoklu reaksiyon izleme (MRM) ve paralel reaksiyon izleme (PRM) olarak da adlandırılan seçilmiş reaksiyon izlemedir (SRM). SRM, öncü m/z ve ürün iyon m/z’den oluşan geçişlerin seçimini içerir. Tersine, PRM yalnızca öncül m/z gerektirir. Seçim sonrası, ürün iyonlarının tam bir anket taraması yapılır. Bu, ölçüm^11’denönce belirli kütle spektrometresinde nicellik için uygun ürün iyonlarının seçilmesinin gerekli olmaması avantajına sahiptir. Hem SRM hem de PRM, cihaza bağlı olarak zamanlanabilir. Planlama, peptitler kromatografik sistemden tanımlanmış saklama sürelerinde elde olduğu için, belirli bir iyonun analiz için dahil edileceğini bir zaman penceresi atama uygulamasıdır. Herhangi bir zamanda sorgulanan iyonların sayısını azaltmak, o sırada planlanan iyonların sorgulanma sıklığını arttırır, böylece veri doğruluğunu artırır.

Genel olarak, ubiquitin topolojisi için hedeflenen proteomik uygulaması, hedeflenen diğer proteomik deneylerle aynıdır. Bununla birlikte, iki temel fark önemlidir: Birincisi, her yerde bulunan zincirlerin stabilitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Hücre lizisi üzerinde zincirleri hızla bozan birden fazla güçlü deubiquitinating enzim (DUB) vardır. Her yerde bulunan spesifik proteazlar iki kategoriye ayrılır: tiyoesterazlar ve metalloproteazlar. Ubiquitin-hidrolazların çoğu tiyoesterazdır ve aktif merkezlerinde sistein kalıntısı taşır. Bu sistein kalıntısını alklating atederek, inaktive edilebilirler. Bu nedenle, N-etirilimid (NEM) gibi alkilleştirici ajanlar içeren ubiquitin stabilizasyon tamponlarının ve yüksek oranda denatüre edici kimyasalların kullanılması ve numunelerin soğutulması başarılı bir analiz için hayati öneme sahiptir. İkincisi, diğer hedeflenen deneylerin aksine, peptit seçimi sabittir. Tipik bir hedefli deneyde, iyi kromatografik ve iyonlaşma performansı için proteotipik bir peptit seçilebilir. K48 gibi bazı topoloji karakteristik peptitler için bu özellikler iyidir, diğerleri için ise daha az arzu edilir. Örneğin, tipik bir ters faz kurulumunda K33 kromatografisi, gerilmiş bir elüsyon profilinin oluşumu nedeniyle zayıftır ve K27 peptidinin zayıf iyonlaşma özellikleri görünürlüğünü MS¹²azaltır.

Bu protokolde, PRM tarafından biyolojik bir numunenin ubiquitin topoloji değerlendirmesinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklıyoruz. Prosedür için örnek veriler, birkaç farklı hücre tipinde MG-132 inhibitör tedavisi kullanılarak proteazomun pertürbasyonu kullanılarak sunulmaktadır.