Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

La estrecha regulación de la función y estabilidad de las proteínas es de suma importancia, ya que son los principales impulsores del control fenotípico de la biología. La función de una proteína se construye a partir de dos componentes: su secuencia intrínsa de polipéptidos y cualquier modificación posttranslacional (PTM). Se han identificado varios PTMs químicos, incluyendo glicosilación, fosforilación, acetilación y metilación^1. En 1975, Goldstein et al.² identificaron una pequeña proteína y la llamaron ubiquitina debido a su naturaleza omnipresente. Se encontró que la ubiquitina era importante en la degradación de^{proteínas 3.} Sin embargo, desde entonces se ha establecido que la función de la ubiquitina como molécula de señalización se extiende mucho más allá de la regulación de la estabilidad de las proteínas. La señalización de ubiquitina participa en una amplia gama de otras funciones biológicas, como la estabilización de proteínas, la autofagia, el control del ciclo celular y el tráfico de proteínas^4.

Mientras que otros PTMs son generalmente binarios (es decir, la proteína se modifica o se deja sin modificar) para un sitio dado, la ubiquitina puede modificar una proteína tanto como monómero como como una cadena polimérica, con la ubiquitina adjunta en sí siendo ubiquitina. Además, esta cadena de poliubiquitinación puede desarrollarse en varias topologías con la ubiquitinación de la ubiquitina anterior que se une a uno de los ocho sitios de eslabones^5,6. La ubiquitina se transfiere mediante un proceso enzimático multipaso(Figura 1)donde la C-terminus de ubiquitina está vinculada a uno de sus siete residuos de lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o al N-terminal de la ubiquitina anterior (denominada ubiquitina M1 o lineal)^5,6. Esta topología de cadena es clave para el destino de la proteína bajo modificación. Por ejemplo, la modificación con una cadena vinculada K48 o K11 conduce a la degradación de la proteína modificada en el proteasoma, mientras que una cadena lineal es necesaria para la activación de la señalización NF-kB. Por lo tanto, la distribución relativa de estas topologías de cadena es relevante para una amplia variedad de cuestiones biológicas.

El uso de espectrometría de masas (EM) es de particular beneficio para el análisis de topología de cadena de ubiquitina, ya que no depende de interacciones basadas en anticuerpos o basadas en afinidad^7,8, muchas de las cuales tienen una especificidad limitada y no diferencian entre los distintos tipos de cadena. Una posibilidad de detección diferente es el uso de mutantes de ubiquitina genéticamente modificados. Aquí, una lisina específica se intercambia por arginina, que no puede soportar la modificación por ubiquitina. La falta de formación de cadena de ubiquitina en la proteína del sustrato se interpreta entonces como evidencia de una topología específica⁹.

La identificación basada en EM de proteínas ubiquitinadas se basa en el hecho de que la C-terminus de ubiquitina contiene un residuo de arginina en la posición 74 que es reconocido por la trippsina durante la preparación proteótica de las muestras para el análisis de EM, separando el doble glicina C-terminal. Este GlyGly (-GG) permanece unido al grupo ε-amino de los residuos de lisina de la proteína del sustrato. Para el análisis de topología de ubiquitina, la modificación se produce en uno de los siete residuos de lisina de ubiquitina. Esto crea un conjunto de siete péptidos clave que llevan un residuo de lisina modificado por GG, específico para cada una de las topologías (Figura 2). Por ejemplo, con la topología K06, la lisina en la posición 6 en la secuencia de aminoácidos estará protegida de la digestión tríptica con una modificación -GG de 114 Da añadida a esta lisina.

La identificación de péptidos predeterminados específicos por EM se conoce como proteómica dirigida, o más específicamente, adquisición de péptidos dirigidos¹⁰. Se han desarrollado dos métodos dependiendo del rendimiento del espectrómetro de masas que se está utilizando. Estos son monitoreo de reacción seleccionado (SRM), también llamado monitoreo de reacción múltiple (MRM), y monitoreo de reacción paralelo (PRM). SRM implica la selección de transiciones que consisten en el precursor m/z y el producto iónico m/z. Por el contrario, PRM requiere sólo el precursor m/z. Después de la selección, se realiza un análisis completo de la encuesta de los iones del producto. Esto tiene la ventaja de que no es necesaria ninguna selección de iones de producto adecuados para la cuantificación en el espectrómetro de masa específico antes de la medición¹¹. Tanto SRM como PRM pueden, dependiendo del instrumento, ser programados. La programación es la práctica de asignar una ventana de tiempo durante la cual se incluirá un ión determinado para su análisis, ya que los péptidos se eluden en los momentos de retención definidos del sistema cromatógráfico. Reducir el número de iones que se interroguen en un momento dado aumenta la frecuencia de interrogatorio de esos iones programados en ese momento, mejorando así la precisión de los datos.

En general, la aplicación de proteómica dirigida para la topología de ubiquitina es la misma que cualquier otro experimento proteómico dirigido. Sin embargo, dos diferencias clave son importantes: En primer lugar, debe considerarse la estabilidad de las cadenas de ubiquitina. Hay múltiples enzimas desubiquitinantes potentes (DUB) que degradan rápidamente las cadenas sobre la lisis celular. Los proteases específicos de la ubiquitina se dividen en dos categorías, las tioesteras y las metaloproteases. La mayoría de las ubiquitina-hidrolasas son tioesteras y transportan un residuo de cisteína en su centro activo. Al alquilar estos residuos de cisteína, se pueden desactivar. Como tal, el uso de búferes de estabilización de ubiquitina que contienen agentes alquilantes, como N-ethylmaleimide (NEM), y productos químicos altamente desnaturalizadores, y mantener las muestras frías es vital para un análisis exitoso. En segundo lugar, a diferencia de otros experimentos dirigidos, la elección del péptido es fija. En un experimento dirigido típico, se puede seleccionar un péptido proteotípico para un buen rendimiento cromatómico e ionización. Para algunos péptidos de características de topología como K48 estas propiedades son buenas, mientras que para otros, son menos deseables. Por ejemplo, la cromatografía K33 en una configuración típica en fase inversa es deficiente debido a la formación de un perfil de elución estirado, y las malas propiedades de ionización del péptido K27 reducen su visibilidad en MS^12.

En este protocolo, describimos cómo realizar la evaluación de topología de ubiquitina de una muestra biológica por PRM. Los datos de ejemplo para el procedimiento se presentan utilizando una perturbación del proteasoma utilizando el tratamiento inhibidor de MG-132 en varios tipos de células diferentes.