Un nouveau modèle sphétroïde tridimensionnel basé sur l’interaction hétérorotypic des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal est établi. Ici, nous présentons la coculture des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal, l’imagerie de time-lapse, et la microscopie confocale pour visualiser la formation des sphéroïdes. Ce modèle tridimensionnel offre une plate-forme pertinente pour étudier les interactions tumeur-stroma et tester la thérapeutique du cancer.
Les interactions tumeur-stroma jouent un rôle important dans la progression du cancer. Les modèles sphéroïdes tumoraux tridimensionnels (3D) sont le modèle in vitro le plus largement utilisé dans l’étude des cellules souches/initiatrices du cancer, de la recherche préclinique sur le cancer et du dépistage des médicaments. Les modèles sphéroïdes 3D sont supérieurs à la culture conventionnelle des cellules tumorales et reproduisent certains caractères importants de tumeurs solides réelles. Cependant, les sphéroïdes conventionnels de tumeur 3D sont constitués exclusivement des cellules de tumeur. Ils manquent de la participation des cellules stromales de tumeur et ont le dépôt extracellulaire insuffisant de matrice (ECM), donc seulement partiellement imitant les conditions in vivo des tissus de tumeur. Nous avons établi un nouveau modèle sphéroïde 3D multicellulaire composé des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal qui imite mieux le microenvironnement hétérogène de tumeur in vivo et son desmoplasia indigène. La formation de sphéroïdes est strictement régulée par les fibroblastes stromaux tumoraux et est déterminée par l’activité de certaines voies de signalisation intracellulaires cruciales (p. ex. signalisation Notch) dans les fibroblastes stromaux. Dans cet article, nous présentons les techniques pour la coculture des fibroblastes de cellules-stromal de tumeur, l’imagerie de time-lapse pour visualiser des interactions cellules-cellules, et la microscopie confocale pour montrer les dispositifs architecturaux 3D des sphéroïdes. Nous montrons également deux exemples de l’application pratique de ce modèle sphéroïde 3D. Ce nouveau modèle sphéroïde 3D multicellulaire offre une plate-forme utile pour étudier l’interaction tumeur-stroma, élucider comment les fibroblastes stromal régulent la tige de cancer/cellules initiatrices, qui déterminent la progression et l’agressivité de tumeur, et explorant la participation de la réaction stromale dans la sensibilité et la résistance de drogue de cancer. Cette plate-forme peut également être un modèle in vitro pertinent pour la découverte de médicaments.
Les tumeurs solides représentent des tissus complexes composés de cellules néoplastiques et d’une grande variété de cellules stromales1,2,3,4. Les fibroblastes stromal, ou fibroblastes cancer-associés (CAF), sont l’une des populations principales de cellules stromales dans la plupart des types de tumeurs pleines. Ils sont impliqués de façon critique dans la régulation de la croissance tumorale, la tige, la métastes, l’angiogenèse, et la résistance aux médicaments par la production de facteurs de croissance, cytokines/chemokines, synthèse de l’ECM et le remodelage des enzymes (p. ex., collagène, fibronectin, et matrice metalloproteases), libération d’exosomes, et interaction hétérocypice-cellulaire5,6,7,7,9 ,10 11, . Les FAC participent également à la détermination de la métasse spécifique aux organes cancéreux en présélectionnant un sous-ensemble de clones tumoraux provenant de populations hétérogènes de cellules tumorales dans la lésion primaire et en favorisant ces clones sélectionnés à être préparés pour la métastes à un organe éloigné spécifique dont le microenvironnement est optimal pour la recolonisation de clones sélectionnés12. En outre, les fibroblastes et leurs facteurs solubles sécrétés et ECM participent à la modulation de l’angiogenèse tumorale13,14, réponse immunitaire anti-tumorale15, et sont même impliqués dans la résistance aux médicaments et la récurrence tumorale16,17.
In vitro 3D modèles sphéroïdes tumoraux ont été développés et utilisés dans la recherche sur le cancer comme un modèle intermédiaire entre les cultures in vitro de cellules cancéreuses et les modèles de tumeur in vivo18,19,20,21. Les modèles sphéroïdes de tumeur 3D ont gagné la popularité dans la recherche de cellules souches de cancer, la recherche préclinique de cancer, et le criblage de drogue parce que ces modèles reproduisent quelques dispositifs importants des tumeurs réelles qui sont absentes dans les monocouches 2D traditionnels22. Beaucoup de modèles sphéroïdes de tumeur 3D existants sont uniquement constitués des cellules de tumeur et manquent la participation des cellules stromal de tumeur. Ceci a souvent comme conséquence les sphéroïdes de tumeur ayant le dépôt insuffisant d’ECM et l’absence des interactions hétérocypic de cellule-cellule. Les sphéroïdes 3D conventionnels formés exclusivement par les cellules cancéreuses et l’adhérence cellulaire homotypique peuvent seulement imiter partiellement les conditions in vivo des tissus tumoraux. Pour surmonter certaines de ces limitations, les investigateurs ont proposé d’incorporer de multiples types de cellules stromal dans les cocultures 3D et ont développé plusieurs modèles sphéroïdes de tumeur 3D d’hétérotype23,24,25,26,27. En outre, les chercheurs ont utilisé des matrices 3D exogènes, y compris des hydrogels naturels ou des polymères synthétiques tels que le polyéthylène glycol, le poly (lactide- co-glycolide), et le poly (N-isopropylacrylamide), pour intégrer des modèles sphéroïdes monocellulaires et multicellulaires, créant ainsi un environnement de soutien cellulaire et reproduisant des interactions de matrice cellulaire28,29, ce qui rend ces systèmes plus biologiques etpluspertinents, ce qui rend ces systèmes plus biologiques et plus pertinents. Cependant, l’incorporation de certains types de cellules stromales, telles que les cellules endothéliales, dans les cocultures 3D entraîne une complexité supplémentaire pour un système in vitro et rend difficile l’étude des interactions hétérorotypic cellules-cellules entre deux types spécifiques de cellules, telles que les interactions cellules cancéreuses-fibroblaste. En outre, les cellules endothéliales dans les tissus réels n’interagissent pas toujours directement avec les cellules cancéreuses et autres cellules stromales parce qu’il y a une couche de membrane de sous-sol enveloppée à l’extérieur des capillaires qui empêche les cellules endothéliales d’interagir directement avec les cellules cancéreuses et d’autres cellules stromales. Dans ces modèles sphéroïdes 3D, les cellules endothéliales incorporées ne forment pas réellement des vaisseaux sanguins, mais interagissent directement avec les cellules cancéreuses et d’autres cellules stromales, quelque chose qui se produit rarement in vivo. De même, les matrices exogènes employées dans certains des modèles sphéroïdes 3D ne sont pas identiques à l’ECM dans les tissus tumoraux réels en termes de structure et de composition. Toutes ces conditions artificielles peuvent donner lieu à des données trompeuses.
Nous avons récemment créé un nouveau modèle sphéroïde 3D multicellulaire composé de cellules tumorales et de CAF. Dans notre modèle, la formation des sphéroïdes de tumeur 3D est entièrement déterminée par CAF. CAF induire et réguler le phénotype de la tige tumorale / cellules initiatrices. L’ECM produit par CAF est naturel et permet à la structure desmoplastique de mieux imiter le microenvironnement tumoral in vivo. Ce nouveau modèle 3D peut être un outil utile pour le dépistage des médicaments contre le cancer et offre une plate-forme unique pour étudier l’interaction tumeur-stroma, élucider comment les FAC régulent les cellules souches/initiatrices du cancer, et explorer la participation des interactions stromales dans la sensibilité et la résistance des médicaments contre le cancer.
Les techniques de culture cellulaire 3D in vitro sont largement utilisées depuis des décennies dans la recherche sur le cancer. Comparé aux systèmes conventionnels de culture de cellules 2D, le microenvironnement 3D récapitule les interactions cellules-cellulaires et/ou cellule-matrice et permet d’imiter les conditions authentiques observées dans les tissus tumoraux. Cependant, un système 3D formé uniquement par les cellules cancéreuses et les interactions cellules-cellules homotypiques ne tient pas compte de l’importance de la conversation croisée hétérorotypique et peut fournir des résultats inexacts dans la recherche. Nous avons récemment développé un nouveau système 3D combinant les cellules cancéreuses et LES FAC pour mieux imiter le microenvironnement hétérogène de tumeur in vivo et sa réaction desmoplastic indigène et raide.
Les fibroblastes sont des composants majeurs du stroma tumoral. CAF sont impliqués dans la régulation de la progression des tumeurs en obtenant des facteurs solubles, ECM / remodelage des enzymes10,11, et exosomes. En outre, CAF jouer un rôle dans la résistance aux médicaments et la récurrence tumorale16,17. Notre système sphéroïde 3D multicellulaire peut être utilisé pour explorer les mécanismes moléculaires des interactions tumeur-stromal et pour traiter la résistance aux médicaments et la récurrence tumorale. Les FAC sont principalement dérivés de fibroblastes quiescentlocaux locaux activés et ont recruté la moelle osseuse circulante MSC, qui subissent la différenciation in situ dans CAF dans le tissu tumoral37,38,39. Dans la présente étude, nous avons utilisé des fibroblastes de la peau pour créer un modèle sphéroïde 3D multicellulaire. Cependant, d’autres types de fibroblastes (par exemple, MSC-DF), fonctionnent également d’une manière très similaire que les fibroblastes de la peau pour réguler la formation de sphéroïdes 3D des cellules tumorales3D 34. MSC-DF peut être généré à partir de la moelle osseuse murine MSC, qui est enrichi par la culture des cellules mononucléaires de moelle osseuse dans le milieu de culture cellulaire MSC pendant environ 10 jours avec des changements moyens périodiques tous les 3 jours. Ces MSC sont caractérisés comme CD73/CD105–/Lin–. Pour différencier MSC en fibroblastes, MSC sont ensuite cultivés avec DMEM complet pendant 2 semaines supplémentaires. MSC-DF sont caractérisés comme‘-SMA ‘/Vimentin ‘/FSP-1‘cellules 36. MSC-DF peut être des régulateurs de tumeur importants. Puisqu’une fraction de CAF dans beaucoup de types de tumeurs pleines sont différenciées des MSC circulants recrutés libérés de la moelle36,MSC-DF peut être des cibles prometteuses de traitement. Ils sont également beaucoup plus facilement manipulés ou ciblés thérapeutiquement avant d’être recrutés dans des tissus tumoraux et différenciés en CAF. Ainsi, notre modèle 3D offre un système idéal pour étudier et tester non seulement les cellules cancéreuses, mais aussi différentes fractions ou sous-populations de CAF. La méthode pour la formation sphéroïde 3D est simple. Les étapes critiques incluent l’utilisation du milieu sans sérum pour la coculture, l’application du bon rapport des fibroblastes aux cellules tumorales, et l’utilisation des plaques de culture appropriées pour la coculture. La limitation potentielle de notre méthode est que la formation des sphéroïdes 3D est en grande partie dépendante de la lignée cellulaire cancéreuse. Notre protocole de formation sphéroïde peut nécessiter l’optimisation du rapport entre les fibroblastes et les cellules cancéreuses si différentes lignées de cellules cancéreuses sont utilisées. Il convient de noter que nous avons utilisé une cellule de mélanome humain et le modèle de coculture fibroblaste souris pour la formation de sphéroïdes 3D, car il est beaucoup plus facile de créer des cellules GOF ou LOF dans les fibroblastes de souris pour l’étude du rôle d’une molécule ou d’une voie de signalisation dans la régulation de la formation sphéroïde tumorale. La capacité des cellules du mélanome humain et des fibroblastes de souris à former des sphéroïdes indique que les molécules nécessaires aux communications cellulaires-cellules fonctionnent contre les espèces. Nous avons récemment testé la coculture de fibroblastes humains avec des cellules de mélanome humain et constaté que les fibroblastes humains peuvent également réguler les cellules du mélanome humain pour former des sphéroïdes 3D.
Nous avons employé les cellules métastatiques humaines de mélanome, C8161, dans notre modèle sphéroïde 3D multicellulaire. Nous avons également testé d’autres cellules de mélanome humain, par exemple, 1205Lu32, qui porte la mutation BRAFV600E, et MeWo, qui exprime des niveaux élevés de CDK4/Kit (ATCC HTB-65), et a constaté qu’ils sont également capables de former des sphéroïdes 3D en coculture. Ceci indique que la formation des sphéroïdes 3D par des cellules de tumeur est indépendante des types de mutations oncogènes. Bien que nous n’ayons pas testé si d’autres types de cellules tumorales autres que le mélanome sont capables de former des sphéroïdes 3D avec des fibroblastes, nos résultats indiquent que la formation de sphéroïdes 3D ne se limite pas à une lignée cellulaire du mélanome et peut ne pas dépendre d’une lignée spécifique de cellules cancéreuses.
Nous avons montré deux exemples d’applications pratiques de notre modèle sphéroïde 3D. Un exemple était d’élucider l’activité intracellulaire de voie de signalisation d’entaille en régulant la tige de cancer/initiateur de phénotype de cellules et la formation sphéroïde 3D. Nous avons démontré que la voie intracellulaire de signalisation d’entaille dans CAF est un commutateur moléculaire contrôlant le phénotype de la tige de cancer/cellules initiatrices utilisant ce modèle sphéroïde 3D. Nos résultats non seulement découvrent un mécanisme moléculaire sous-jacent à la régulation stromale des cellules de tige/initiatrice de cancer et de l’hétérogénisme de cancer, mais soulignent également que la voie de Notch dans CAF est une cible critique pour des thérapies de mélanome. Cet exemple indique que notre modèle sphéroïde 3D est très utile pour étudier les mécanismes pour les interactions cancéreux-stromal de fibroblaste et identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Un autre exemple a été de tester la réponse médicamenteuse des cellules souches cancéreuses/initiatrices en présence des FAC. Il est bien connu que la réponse médicamenteuse des cellules cancéreuses, y compris les cellules souches cancéreuses/initiatrices, varie en présence et en absence de FAC. La présence de CAF dans ce système in vitro rend ce modèle plus pertinent sur le plan clinique et les résultats des tests générés sont plus fiables. De plus, notre système sphéroïde 3D est polyvalent. Il peut être utilisé à diverses fins. Par exemple, si des cellules cancéreuses pharmacorésistantes sont employées dans ce modèle 3D, il peut être changé pour traiter la résistance de drogue et peut-être la répétition de tumeur. Il peut également être modifié pour tester ou dépister les médicaments qui ciblent principalement les FAC pour le traitement du cancer. Les FAC sont récemment devenues des cibles thérapeutiques prometteuses. Il y a des avantages à cibler les FAC. Tout d’abord, par rapport aux cellules tumorales qui sont anormales (souvent avec des altérations génétiques) et intelligentes (facilement gagner une résistance à la chimio et les radiothérapies), CAF dans le tissu tumoral sont des cellules normales et génétiquement plus stable, de sorte qu’ils sont moins susceptibles de développer une résistance aux traitements. Deuxièmement, le ciblage des FAC ne dépend pas du type de mutations oncogènes dans les cellules tumorales. Troisièmement, le ciblage des FAC peut obtenir de multiples effets de succès par le biais de fibroblastes-dépendants anti-tumeur, anti-angiogenèse, et / ou la réponse immunitaire du cancer modulation. Notre modèle sphéroïde 3D est un outil puissant pour la découverte de divers ensembles de stratégies thérapeutiques contre le cancer.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Omaida C. Velazquez (Université de Miami) pour sa collaboration, sa consultation et sa discussion utiles; Dr Jie Li (Université de Miami) pour fournir des cellules MeWo; et le Dr Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) pour avoir fourni toutes les autres cellules du mélanome. Nous remercions également la Dre Marcia Boulina, directrice de l’installation de base d’imagerie analytique de l’Université de Miami, pour son analyse de l’imagerie. Zhao-Jun Liu a reçu le soutien de subventions du Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award- 09BN-11), de la Women’s Cancer Association (la53e subvention annuelle) et de fonds internes de l’Université de Miami.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
DakoCytomation | Dako | x0909 | |
DAPI | |||
Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
Olymupus CellSens | Olympus | ||
PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |