JoVE Journal > Biochemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生化学

Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Published: January 21, 2020
doi:
10.3791/60659
,
1Biomedical Engineering Program,Ohio University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Ohio University

概要

Eritrositlerde eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, kalsiyum iyonofor, iyonomisin kullanılarak programlanmış hücre ölümü için bir protokol sağlanır. Başarılı eritoz membran dış broşüründe lokalizasyon fosfatidilseriniz izleyerek değerlendirilir. Protokolün başarısını etkileyen faktörler incelenmiş ve en uygun koşullar sağlanmıştır.

Abstract

Eritrosit programlı hücre ölümü olan eritoz, bir dizi hematolojik hastalıkta ve eritrositlerin yaralanması sırasında ortaya çıkar. Eritoretik hücrelerin ayırt edici özelliği hücre zarının bileşimsel asimetri kaybıdır, membran dış broşürfosfatidilserine translokasyon yol. Bu süreç Ca2 artanhücre içi konsantrasyonu tarafından tetiklenir + hangi scramblase aktive, membran broşürler arasında fosfolipidlerin çift yönlü hareketini kolaylaştıran bir enzim. Çeşitli hastalıklı koşullarda eritozun önemi göz önüne alındığında, in vitroeritoz unneden çalışmalar yapılmıştır. Bu tür çabalar genellikle kalsiyum iyonofor dayanıyordu, ionomisin, hücre içi Cageliştirmek için 2 + konsantrasyonu ve eritotsis indüklemek. Ancak literatürde iyonomisin kullanılarak eritotoz unneden işlem le ilgili birçok tutarsızlık bildirilmiştir. Burada, insan eritrositlerinde iyonomisin kaynaklı eritoz için adım adım protokol bildiriyoruz. İonofor konsantrasyonu, kuluçka süresi ve glikoz tükenmesi gibi prosedürdeki önemli adımlara odaklanır ve temsili sonuç sağlarız. Bu protokol laboratuvarda tekrartekrar eritotis indüklemek için kullanılabilir.

Introduction

Eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, eritoz olarak da bilinir, birçok klinik durum ve hematolojik bozukluklarda yaygındır. Eritoz hücre büzülmesi ve hücre plazma zarında fosfolipid asimetri kaybı ile ilişkilidir1,2. Asimetri kaybı fosfatidilserin translokasyonu sonuçları (PS), normalde iç broşür lokalize bir lipid3,4, hücre dış broşür, hangi fagositoz makrofajlar sinyalleri ve kusurlu eritrositkaldırmak5,6,7,8. Eritrositlerin normal ömrü sonunda eritofotik hücrelerin makrofajlar tarafından uzaklaştırılması dolaşımdaki eritrositlerin dengesini sağlar. Ancak, hastalıklı koşullarda, orak hücre hastalığı ve talasemi gibi9,10,11, gelişmiş eriptoz ciddi anemi neden olabilir2. Hematolojik hastalıklardaki önemi nden dolayı, eritpoza neden olan veya inhibe eden faktörlerin ve bu sürecin altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilgi vardır.

Sağlıklı eritrositlerin plazma membranı asimetriktir ve dış ve iç broşürlerde farklı fosfolipidler lokalize dir. Membran asimetrisi öncelikle membran enzimlerinin etkisi ile düzenlenir. Aminofosfolipid translocase aminofosfolipidlerin taşınmasını kolaylaştırır, PS ve fosfatidylethanolamine (PE), hücre iç broşür bu lipidler yönlendirerek. Öte yandan, floppase fosfolipidler içeren kolin taşır, fosfatidilkolin (PC) ve sfingomyelin (SM), hücre zarının iç gelen12. Ancak, sağlıklı hücrelerin aksine, eritrositler membran karıştırılır. Bu aminofosfolipidlerin çift yönlü taşıma kolaylaştırarak fosfolipid asimetri sayarıya üçüncü bir enzim, scramblaz, eylem kaynaklanmaktadır13,14,15,16. Scramblase Ca2 +yüksek hücre içi seviyeleri ile aktive edilir. Bu nedenle, kalsiyum iyonoforlar, hangi hücre zarı arasında Ca2 + taşımakolaylaştırmak12,eritrosit etkili indükleyiciler vardır.

Bir kalsiyum ionofor, ionomisin, yaygın eritrositlerde eritrosit12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26eritrosoz neden olmak için kullanılmıştır . İonomisin bağlamak ve Ca2 + iyon yakalamak için gerekli olan hidrofilik ve hidrofobik gruplar vardır, ve sitosolik alana taşıma27,28,29. Bu, PS’nin dış broşüre bağlanması ve scramblazın aktivasyonuna yol açar, bu da PS12’yeyüksek bir yakınlığı olan hücresel protein olan annexin-V kullanılarak kolayca tespit edilebilir. İyomit ile eritotazın tetiklediği yaygın olarak rapor edilse de literatürde önemli yöntem tutarsızlığı bulunmaktadır(Tablo 1). Eritotsitlerin popülasyonu iyonofor konsantrasyonu, iyonofor ile tedavi süresi ve hücre dışı ortamın şeker içeriği (glikoz tükenmesi katyon kanallarını aktive eder ve Ca2+’nın sitosolik alana girişini kolaylaştırır)30,31gibi farklı faktörlere bağlıdır. Ancak literatürde bu faktörlerde çok az tutarlılık vardır, bu da eritotozun tekrartekrar in vitroolarak gerçekleştirilmesi zorhale getirmektedir.

Bu protokolde, insan eritrositlerinde eritoza neden olmak için adım adım bir prosedür sayılacağız. Glukoz tükenmiş tamponda Ca2+ konsantrasyonu, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve pre-kuluçka gibi başarılı eritotzu etkileyen faktörler incelenir ve optimal değerler bildirilmiştir. Bu prosedür, glukoz içermeyen bir tamponda eritrositlerin pre-inkübasyon önemli ölçüde glukoz içeren tampon ile karşılaştırıldığında eritoz yüzdesini artırdığını göstermektedir. Bu protokol çeşitli uygulamalar için eritrosit eritrosit üretmek için laboratuvarda kullanılabilir.

Protocol

Aşağıda açıklanan protokolde kullanılan tüm insan kanı örnekleri tanımlanmamış numuneler olarak satın alınmıştır. Hiçbir insan denek doğrudan dahil edildi veya bu çalışma için işe. Helsinki Bildirgesi’nin yönergeleri, araştırma insan denekleri kapsadığında kullanılmalıdır. 1. Tam kandan eritrosit izolasyonu Bir mikrosantrifüj tüpüne asit sitrat dekstrozuna (ACD) (4 °C’de depolanır) 500 μL’lik tam kan ekleyin.NOT: Tam kan ACD olarak satın al…

Representative Results

İonomisin konsantrasyonunun optimizasyonu İzomisin eritotaz neden olmak için gerekli iken, artan iyonomisin konsantrasyonları hemoliz yol açabilir (eritrositlerin lysis ve hemoglobin salınımı), kaçınılması gereken. 2 saat için Ringer çözeltisinde 1 μM iyonomisin ile eritrositlerin tedavisi, annexin-V Alexa Un 488 eşleç ve FACS analizi ile nicelleştirme ile başarılı etiketleme ile kanıtland…

Discussion

Bu işlemin amacı, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve eripozun başarılı indüksiyonunu sağlamada önemli faktörler olan hücre dışı glukoz konsantrasyonu için en uygun değerleri sağlamaktır. Protokoldeki kritik bir adım, önemine rağmen literatürde yeterince vurgulanamayan hücre dışı glikozun tükenmesidir. Normal Ringer çözeltisindeki şeker içeriği (5 mM) eritmetoz üzerinde önleyici etkiye sahiptir. Hücre dışı ortamda glikoz tükenmesi hücresel strese neden olur ve protein kiziaz …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibe R15ES030140 ve NSF hibe CBET1903568 tarafından desteklenmiştir. Russ Mühendislik ve Teknoloji Koleji ve Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü’nden de finansal destek kabul edilmektedir.

Materials

96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. 代謝. 39 (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 – a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. 生化学. 46 (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte “Programmed Cell Death” Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. . Flow Cytometry Protocols. , (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte’s Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics – Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).

タグ

EryptosisRed Blood CellsCalcium IonophoreIonomycinRinger SolutionGlucose-free BufferHematocritCell SuspensionCentrifugationIncubation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image