Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция
概要
Предусмотрен протокол индукции эриптоз, запрограммированный клеточной смерти в эритроцитах, с использованием ионофора кальция, иономицина. Успешный эриптоз оценивается путем мониторинга локализации фосфатидилсерина во мембранной внешней листовке. Были изучены факторы, влияющие на успешность протокола, и обеспечены оптимальные условия.
Abstract
Эриптоз, эритроцит запрограммированной клеточной смерти, возникает при ряде гематологических заболеваний и при травме эритроцитов. Отличительной чертой эриптотических клеток является потеря композиционной асимметрии клеточной мембраны, что приводит к транслокации фосфатидилсерина в мембранную внешнюю листовку. Этот процесс вызван повышенной внутриклеточной концентрацией Ca2 ,который активирует скремблаз, фермент, который облегчает двунаправленное движение фосфолипидов между мембранными листовками. Учитывая важность эриптоз в различных заболеваний, были предприняты усилия, чтобы вызвать эриптоз в пробирке. Такие усилия, как правило, опирались на ионофор кальция, иономицин, для повышения внутриклеточной концентрации Ca2 “и вызвать эриптоз. Тем не менее, многие расхождения были зарегистрированы в литературе в отношении процедуры индуцирования эриптоз с использованием иомамицина. В этом мы сообщаем о поэтапном протоколе для иономицина индуцированного эриптозва в эритроцитах человека. Мы фокусируемся на важных шагах в процедуре, включая концентрацию ионофора, время инкубации и истощение глюкозы, и обеспечиваем репрезентативный результат. Этот протокол может быть использован для воспроизводимого индуцирования эриптоза в лаборатории.
Introduction
Запрограммированная гибель клеток в эритроцитах, также известных как эриптоз, распространена во многих клинических условиях и гематологических расстройствах. Eryptosis связано с усадкой клеток и потерей фосфолипидной асимметрии в мембране плазмы клетки1,2. Потеря асимметрии приводит к транслокации фосфатидилсерина (PS), липида, обычно локализуемого во внутренней листовке3,4, к клеточной внешней листовке, которая сигнализирует макрофагам на фагоциты и удаляет дефектные эритроциты5,6,7,8. В конце нормальной продолжительности жизни эритроцитов удаление эриптотических клеток макрофагами обеспечивает баланс эритроцитов в обращении. Однако, в болезненных условиях, таких как серповидно-клеточная болезнь и талассемия9,10,11, повышенный эриптоз может привести к тяжелой анемии2. Из-за его важности в гематологических заболеваний, существует значительный интерес к изучению факторов, вызывающих или ингибирующих эриптоб и молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.
Плазменная мембрана здоровых эритроцитов асимметрична, с различными фосфолипидами, локализующихся на наружных и внутренних листовках. Мембранная асимметрия в первую очередь регулируется действием мембранных ферментов. Аминофосфолипид транслокс облегчает транспортировку аминофосфолипидов, PS и фосфатидиэтаноламин (ПЭ), направляя эти липиды на клеточной внутренней листовке. С другой стороны, флоппас транспортирует холин, содержащий фосфолипиды, фосфатидилхолин (ПК) и сфингомиелин (СМ), от внутренней к внешней листовке клеточной мембраны12. Однако, в отличие от здоровых клеток, мембрана эритроцитов скремблируется. Это связано с действием третьего фермента, скремблаза, который нарушает фосфолипидную асимметрию, облегчая двунаправленный перенос аминофосфолипидов13,14,15,16. Scramblase активируется повышенными внутриклеточными уровнями Ca2 . Таким образом, ионофоры кальция, которые облегчают транспортировку Ca2 “через клеточную мембрану12, являются эффективными индукторами эриптоса.
Иономицин, ионофор кальция, широко используется для индуцирования эриптоза в эритроцитах12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Иономицин имеет как гидрофильные, так и гидрофобные группы, которые необходимы для связывания и захвата иона Ca2 и транспортировать его в цитозолическое пространство27,28,29. Это приводит к активации скремблаза и транслокации PS на внешнюю листовку, которая может быть легко обнаружена с помощью приложения-V, клеточного белка с высоким сродством к PS12. Хотя запуск эриптоза иомамицином обычно сообщается, есть значительное расхождение метода в литературе (Таблица 1). Популяция эритроцитов, проходящих эриптоз, зависит от различных факторов, таких как концентрация ионофора, время лечения ионофором, а также содержание сахара в внеклеточной среде (истощение глюкозы активирует каналы катионов и облегчает вхождение Ca2 в цитозоликическое пространство)30,31. Тем не менее, есть мало последовательности в этих факторов в литературе, что затрудняет выполнение эриптоза воспроизводимо in vitro.
В этом протоколе мы представляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эритроциты человека. Учитываются факторы, влияющие на успешный эрипток, включая концентрацию Ca2, концентрацию ионофора, время лечения и предварительное инкубацию в глюкозно-обеденный буфер и сообщается об оптимальных значениях. Эта процедура показывает, что прединкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно увеличивает процент эриптоза по сравнению с глюкозосодержащим буфером. Этот протокол может быть использован в лаборатории для производства эриптотических эритроцитов для различных применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью данной процедуры является обеспечение оптимальных значений концентрации ионофора, времени лечения и внеклеточной концентрации глюкозы, которые являются важными факторами обеспечения успешной индукции эриптобиа. Важным шагом в протоколе является истощение внеклеточной глюко?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH R15ES030140 и грантом NSF CBET1903568. Подтверждена также финансовая поддержка со стороны Русского инженерно-технологического колледжа и кафедры химической и биомолекулярной инженерии Университета Огайо.
Materials
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
参考文献
- Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
- Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
- Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. 代謝. 39 (8), 794-798 (1990).
- Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
- de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
- Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
- Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
- Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
- Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
- Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
- Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
- Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 – a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
- Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
- Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
- Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
- Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
- Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
- Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
- Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
- Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
- Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
- Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
- Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
- Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
- Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
- Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. 生化学. 46 (8), 2233-2238 (2007).
- Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
- Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
- Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
- Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte “Programmed Cell Death” Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
- Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
- Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
- Jaroszeski, M. J., Heller, R. . Flow Cytometry Protocols. , (2003).
- Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
- Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte’s Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
- Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
- Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
- Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
- Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
- Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics – Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).
