Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

A morte celular programada em eritrócitos, também conhecida como eritrose, é comum em muitas condições clínicas e distúrbios hematológicos. A eryptose está associada ao encolhimento celular e à perda de assimetria fosfolípida na membrana plasmática celular^1,2. A perda de assimetria resulta na translocação de fosfatidylserine (PS), um lipídio normalmente localizado no folheto interno^3,4, para o folheto exterior celular, que sinaliza para macrófagos para phagocitose e remover eritrócitos defeituosos^5,6,7,8. No final da vida útil normal dos eritrócitos, a remoção de células eritptoticas por macrófagos garante o equilíbrio dos eritrócitos em circulação. No entanto, em condições doentes, como doença falciforme e talassemia^9,10,11,eritrese reforçada pode resultar em anemia grave². Devido à sua importância em doenças hematológicas, há um interesse significativo em examinar os fatores que induzem ou inibem a eryptose e os mecanismos moleculares subjacentes a este processo.

A membrana plasmática de eritrócitos saudáveis é assimétrica, com diferentes fosfolípidos localizando-se nos folhetos externos e internos. A assimetria da membrana é regulada principalmente pela ação das enzimas da membrana. O translocase aminofosfosfórico facilita o transporte de aminofosfípidos, PS e fosfatidylethanolamina (PE), direcionando esses lipídios para o folheto interno celular. Por outro lado, o floppase transporta a colina contendo fosfolípidos, fosfatatidylcholine (PC) e esfingomielina (SM), do interior ao folheto externo da membrana celular¹². No entanto, ao contrário das células saudáveis, a membrana dos eritrócitos eritptoticos é embaralhada. Isto é devido à ação de uma terceira enzima, scramblase, que interrompe a assimetria fosfolípido, facilitando o transporte bidirecional de aminofosfosfípidos^13,14,15,16. Scramblase é ativado por níveis intracelulares elevados de Ca²⁺. Portanto, os ionóforos de cálcio, que facilitam o transporte de Ca²⁺ através da membrana celular^12,são indutores eficientes de eitosse.

Ionomicina, um ionóforo de cálcio, tem sido amplamente utilizado para induzir erittose em eritrócitos^{12,17,18,19,20,22,23,24,25,26}. Ionomicina tem grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, que são necessários para ligar e capturar íon Ca^{2 +,} e transportá-lo para o espaço citosólico^27,28,29. Isso leva à ativação de scramblase e translocação de PS para o folheto externo, que pode ser facilmente detectado usando annexin-V, uma proteína celular com uma alta afinidade com PS¹². Embora provocar a eryptose por ionomicina seja relatado geralmente, há uma discrepância considerável do método na literatura(tabela 1). A população de eritrócitos submetidos à eritrose depende de diferentes fatores, como concentração de ionóforo, tempo de tratamento com ionóforo e o teor de açúcar do ambiente extracelular (esgotamento da glicose ativa canais de caation e facilita a entrada de Ca²⁺ no espaço citosólico)^30,31. No entanto, há pouca consistência nesses fatores na literatura, dificultando o desempenho da eritose reproduzivelmente in vitro.

Neste protocolo, apresentamos um procedimento passo a passo para induzir eritrose em eritrócitos humanos. Os fatores que afetam a eryptose bem-sucedida que inclui a concentração de Ca^2+, concentração do ionophore, tempo do tratamento, e pre-incubação no amortecedor glicose-esgotado são examinados e os valores óptimos são relatados. Este procedimento demonstra que a pré-incubação de eritrócitos em um amortecedor livre de glicose aumenta significativamente a porcentagem de eritrose em comparação com tampão contendo glicose. Este protocolo pode ser usado em laboratório para produzir eritrócitos eritptoticos para várias aplicações.