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生化学

칼슘 이오노포어를 사용하여 적혈구에 있는 에리녹증의 유도

Published: January 21, 2020
doi:
10.3791/60659
,
1Biomedical Engineering Program,Ohio University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Ohio University

概要

적혈구에서 적혈구의 세포 사멸, 칼슘 이오노포어, 요오마이신을 사용하여 적혈구의 유도를위한 프로토콜이 제공됩니다. 성공적인 에적엽증은 막 외부 전단지에서 국소화 포스파티딜세린을 모니터링하여 평가됩니다. 프로토콜의 성공에 영향을 미치는 요인을 검토하고 최적의 조건을 제공했습니다.

Abstract

적혈구, 적혈구 프로그램 세포 사멸, 혈액 학적 질환의 숫자와 적혈구 부상 동안 발생합니다. 홍반 세포의 특징은 세포막의 조성 비대칭의 손실이며, 막 외부 전단지로 포스 파티딜세린의 전좌로 이어진다. 이 과정은Ca2+의세포 내 농도 증가에 의해 유발되며, 이는 멤브레인 리플렛 사이의 인지질의 양방향 이동을 용이하게하는 효소인 스크램블라제를 활성화시킵니다. 다양한 질병 조건에서 에적혈구증의 중요성을 감안할 때, 시험관내에서에리프토시스를 유도하기 위한 노력이 있었다. 이러한 노력은 일반적으로 칼슘 이오노포어, 요오마이신에 의존하여 세포내 Ca2+ 농도를 향상시키고 에리프토증을 유발합니다. 그러나, 많은 불일치는 요오마이신을 사용하여 에적ptosis를 유도하기위한 절차에 관한 문헌에서보고되었다. 본 명세서에서, 우리는 인간 적혈구에서 이오노마이신 유도 적혈구에 대한 단계별 프로토콜을 보고한다. 우리는 이오노포어 농도, 배양 시간 및 포도당 고갈을 포함하여 절차의 중요한 단계에 집중하고, 대표적인 결과를 제공합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 재생성 적으로 홍채증을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

적혈구에서 프로그래밍 된 세포 죽음, 또한 적혈구로 알려진, 많은 임상 조건 및 혈액 학적 장애에서 일반적이다. 에반색은 세포혈장막1,2에서세포 수축 및 인지질 비대칭의 손실과 관련이 있다. 비대칭의 손실은 내부 전단지3,4에국한된 지질인 포스파티딜세린(PS)의 전좌를 초래하며, 이는 세포 외부 리플렛에, 이는 식세포에 대식세포를 신호하고 결함이 있는 적혈구5,6,7,8을제거한다. 적혈구의 정상적인 수명이 끝나면 대식세포에 의한 적혈구 세포를 제거하면 순환에 적혈구의 균형이 보장됩니다. 그러나, 겸상적혈구 및 탈라세미증9,10,11,강화된 적혈구와 같은 병든조건에서는심한 빈혈을 초래할 수 있다 2. 혈액학적 인 질병에 그것의 중요성 때문에, 이 프로세스의 밑에 있는 적혈구및 분자 기계장치를 유도하거나 억제하는 요인을 검토에 있는 중요한 관심사가 있습니다.

건강한 적혈구의 혈장 막은 비대칭이며, 다른 인지질이 외부 및 내부 전단지에 국한됩니다. 막 비대칭은 주로 막 효소의 작용에 의해 조절됩니다. 아미노포스포이시드 트랜스로케이스는 이러한 지질을 세포 내부 리플렛으로 유도하여 아미노포스포이시드, PS 및 포스파티딜레탄아민(PE)의 수송을 용이하게 한다. 한편, 플롭파제는 인지질, 포스파티딜콜린(PC) 및 스핑고미엘린(SM)을 함유하는 콜린을세포막(12)의외부 리플렛으로 내부에서 수송한다. 그러나 건강한 세포와 달리 적혈구의 막이 스크램블됩니다. 이것은 아미노포스포이시드13,14,15,16의양방향 수송을 촉진하여 인지질 비대칭을 방해하는 제 3 효소 인 스크램블라제의 작용에 기인한다. 스크램블라제는 Ca2+이상의 높은 세포내 수준에 의해 활성화됩니다. 따라서세포막(12)을가로질러Ca2+의 수송을 용이하게 하는 칼슘 이온포르는 적색증의 효율적인 유도제이다.

요오노마이신, 칼슘 이오노포어는 적혈구12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26에서적혈구를 유도하는 데 널리 사용되어 왔다. 이오노마이신은Ca2+ 이온을 결합하고 포획하는 데 필요한 친수성 및 소수성 그룹을 모두 가지고 있으며, 이를 세포순환 공간27,28,29로수송한다. 이는 PS12에대한 높은 친화성을 가진 세포 단백질인 annexin-V를 사용하여 쉽게 검출될 수 있는 외부 리플렛으로의 스크램블라제 및 전좌의 활성화를 유도한다. 이오노마이신에 의한 에릭토증을 유발하는 것은 일반적으로 보고되지만, 문헌에 상당한 방법 불일치가있다(표 1). 적혈구의 인구는 이오노포어 농도, 이오노포어를 통한 치료 시간 및 세포외 환경의 당도(포도당 고갈이 양이온 채널을 활성화하고 Cytosolic 공간으로Ca2+의 진입을 용이하게 함)30,31과같은 다른 요인에 의존한다. 그러나, 문헌에서 이러한 요인에 약간의 일관성이 있어 시험관 내에서에리프토증을 재현하기 어렵게 만듭니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 인간 적혈구에 있는 홍색토증을 유도하는 단계별 절차를 제시합니다. Ca2+ 농도, 이오노포어 농도, 치료 시간 및 포도당 고갈 된 완충제의 사전 배양을 포함하여 성공적인 에적혈관증에 영향을 미치는 요인을 검사하고 최적의 값이보고됩니다. 이 절차는 포도당 없는 완충액에 있는 적혈구의 사전 배양이 포도당 함유 완충액에 비해 적색지대의 백분율을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 응용 프로그램에 대한 적혈구 적혈구를 생산하기 위해 실험실에서 사용할 수 있습니다.

Protocol

아래에 기술된 프로토콜에 사용된 모든 인간 혈액 샘플은 비식별 샘플로서 구입하였다. 어떤 인간 과목이 직접 참여 하거나이 연구에 대 한 모집 했다. 헬싱키 선언의 지침은 연구가 인간의 과목을 포함 할 때 사용되어야한다. 1. 전혈로부터적혈구 분리 500 μL의 전혈을 산구연산 덱스트로스(ACD)(4°C에서 보관)에 미세원심지 튜브에 넣습니다.참고: 전혈은 ACD에서 구입…

Representative Results

이오노마이신 농도 최적화 이오노마이신은 홍색증을 유도하는 데 필요한 반면, 증가 된 요오마이신 농도는 혈우만에 발생할 수 있습니다 (즉, 적혈구의 포해와 헤모글로빈의 방출), 이는 피해야 할 필요가있다. 링거 용액에서 1 μM 요오마이신을 2 시간 동안 적혈구로 처리하면 아넥신-V 알렉사 가루 488 컨쥬게이트?…

Discussion

이 절차의 목표는 이오노포어 농도, 치료 시간 및 적색증의 성공적인 유도를 보장하는 데 중요한 요소인 세포외 포도당 농도에 대한 최적의 값을 제공하는 것입니다. 프로토콜의 중요한 단계는 그 중요성에도 불구하고 문헌에서 충분히 강조되지 않은 세포 외 포도당의 고갈입니다. 정상 링거 용액 (5 mM)의 당도는 에리펙트증에 억제 효과가 있습니다. 세포 외 환경에서 포도당 고갈은 세포 스트레?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH 교부금 R15ES030140 및 NSF 교부금 CBET1903568에 의해 지원되었다. 러스 공과대학과 오하이오 대학교 화학 및 생물분자 공학부의 재정 지원도 인정받고 있습니다.

Materials

96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
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参考文献

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Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).
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